人胰岛素的工业制备

人工胰岛素制备工艺的研究及其进展

摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。

关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原；

在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。

这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。

所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。

1重组人工胰岛素的生产原理

通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的

高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。

2重组人工胰岛素的生产工艺流程

2.1菌种的制备

2.1.1目的基因的提取

既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：

（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针

（2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。

（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用（4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。

2.1.2提取质粒

使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒

质粒为环状。碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

2.1.3基因重组将

取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。

2.1.4将质粒送回大肠杆菌

再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。

将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。

2.2胰岛素的产生和精制（即菌种的发酵培养）

重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年的发酵工程为基础，结合现在的基因工程技术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程更是可靠和安全的。

发酵培养流程见下图表：

对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养

3药物检测

这种重组人工胰岛素的检测重点应该是

①测定生物活性

②效价测定

③控制产品中杂质潜在有害物质

④保证产品安全性和有效性

胰岛素的生物效应包括许多方面, 它是体内唯一能降低血糖的激素。也是唯一

时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。胰岛素的主要靶器官为肝脏、肌肉及脂肪组织, 它控制着三大营养物质糖、蛋白质、脂肪的代谢和贮存。最明显的作用是影响糖的代谢, 降低血糖,即促进肝脏及肌肉组织中葡萄糖的利用, 激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶等的活性, 促进糖原的合成并抑制糖原的分解。此外, 对肝脏来说还有抑制蛋白质分解的作用;在肌肉组织中促进+K从细胞外向细胞内的转运;在脂肪组织中促进氨基酸由细胞外向细胞内转运,促进脂肪的合成,抑制脂肪的分解等作用。这些在细胞水平上对代谢系统的作用是基于胰岛素与其受体的结合得以实现的。

关于效价的测定《中华人民共和国药典》指出供试品制成盐酸溶液，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长214nm处检测重组人胰岛素的吸收值，计算出其含量。

无数临床试验证明，到目前为止，重组人工胰岛素是稳定糖尿病最好的选择，其没有潜在的危险，并且安全可靠。

4问题与展望

胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，但因注射给药让许多患者产生畏惧心理，使其作用发挥受到限制。

为了减少不便和疼痛，医药界正在全力以赴投入研究，开发更新的胰岛素剂型及给药方式。目前有关新式胰岛素产品的研究方向，可归纳为3类:

1.新的给药方式，例如:口服、吸入;

2.改变药物代谢机制;

3.改进注射手段，让使用者无痛;

这是国际国内胰岛素类药物研究发展的前沿和趋势。

4.1非注射型胰岛素

让胰岛素和其他药物一样成为非注射型药品，通过口服、鼻吸等途径进入人体而免除注射，需要研究解决制剂吸收的问题。由于胰岛素本身的疗效和安全性已经非常确定，而改变的是给药途径，因此吸收程度和速度是需要解决的首要问题。

4.2口服胰岛素

胰岛素本身为蛋白质，口服后会被胃肠道降解破坏，所以常规胰岛素不能口服。