抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点
抗生素微生物检定管碟法在中国药典2005版的应用及操作要点
抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
中国药典微生物检查方法的主要增修订内容
中国药典微生物检验附录的主要增修订内容王知坚•微生物限度检查法•无菌检查法•抑菌剂效力检查法•非无菌药品微生物限度检查指导原则•微生物实验室受控洁净环境的监控指导原则•无菌检查用隔离系统验证指导原则•微生物鉴定指导原则微生物限度检查法•修订的背景•修订的主要过程•制订过程中的热点问题•修订的背景–国外的情况ICH有关各方于2002~2004年期间就无菌检查法开展了充分的协调，并相继于2005年在USP、EP、BP和JP中收载。
关于化学药品、原料药的微生物检查方法和标准，有关各方于2007年达成一致（第四阶段），并相继在USP30、EP5.6和JP15第一增补本中收载了协调一致的微生物计数法、控制菌检查法和限度标准由于中药产品的复杂性，其微生物限度标准目前尚未进行协调–国内的情况2008年，启动2010年版中国药典微生物限度检查法的增修订工作，设置了采用ICH协调案收载的培养基体系开展预研的课题，并考虑在该版药典中直接收载与协调案高度一致的检验方法，但没有最终实施2010年版药典执行1年后，考虑到国际交流的需要，在接受了国内有关企业的反馈意见后，决定在微生物检验方法上与国际标准进行统一•修订的主要过程–2011年3月，根据2015年药典附录编制大纲的要求，确定了微生物限度检查法修订的主要工作内容和任务分工，分别由陕西所、中检院和广东所负责起草初稿–2011年12月，经过3次较大篇幅的修改，基本确定了微生物计数法、控制菌检查法和限度标准这三个文件的征求意见稿–2012年3月和9月，先后两次在药典会网站上向全国公开征求意见，并对收集到的意见进行梳理，根据合理化的意见建议对讨论稿再次进行了修改–2012年12月，在杭州会议上对稿件进行了审议，基本定稿–2013年2月，将定稿在药典会网站上再次公示–何时执行注：《中国药典》2015年版拟对“附录XIII C微生物限度检查法”做出全面修订，修订后的方法包括三个附录，即“计数法”、“控制菌”、“标准”。
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
抗生素微生物检定操作规程
[转载]抗生素微生物检定法（上）(2010-07-30 16:00:26)转载原文标签：转载原文地址：抗生素微生物检定法（上）作者：yingying本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
《中华人民共和国药典》2005年版附录-抗生素微生物检定法
Ⅱ-ⅪA抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法：管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。
微生物限度检查增修定内容
新版药典微生物学检查方法增修定内容大家下午好：今天我和大家一起共同学习2010年版《中国药典》微生物学检查方法增修定内容。
首先我们先了解2010年版《中国药典》新增内容，2010年版《中国药典》分为三部出版，一部为中药，二部为化学药，三部为生物制品。
各部内容主要包括凡例、标准正文和附录三部分，其中附录由制剂通则、通用检测方法、指导原则及索引等内容构成。
药典二部收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品以及药用辅料等。
药典三部收载生物制品。
新版药典在凡例、品种的标准要求、附录的制剂通则和检验方法等方面均有较大的改进和发展，特别是对药品的安全性、有效性和质量可控性方面尤为重视。
新版药典在继承前版药典的基础上，做了大量发展和创新性的工作。
本版药典具有以下几个特点：一是新增与淘汰并举，收载品种有较大幅度的增加；二是药品检测项目和检测方法增加，标准提高；三是中药标准有突破和创新；四是新版药典在凡例、品种的标准要求、附录的制剂通则等方面均有较大的变化和进步；五是力求覆盖国家基本药物目录品种和社会医疗保险报销药品目录品种。
2010年版《中国药典》在2005年版的基础上，做了大幅度的增修订和新增品种的工作。
本版药典共收载品种4598种，新增1462种。
其中：一部收载品种2136种，新增990种、修订612种；二部收载品种2220种，新增341种、修订1549种；三部收载品种131种，其中新增27种、修订104种。
药用辅料、标准新增130多种。
附录其中药典一部新增14个、修订54个；药典二部新增15个、修订70个；药典三部新增18个、修订38个。
主要特色与2005年版药典相比，新版药典新增加品种总计1358个，总数达到4615个，形成了中药材、中药饮片、中成药、化学药品、药用辅料、生物制品等各类齐全的药品标准体系，基本覆盖国家基本药物目录品种的需要。
新版药典广泛收载国内外先进成熟的检测技术和分析技术，品种标准进一步扩大对新技术的应用使化学药品标准与国际先进水平趋于一致，中药的专属性质量控制方法进一步提高。
抗生素微生物检定标准操作规程
山西振东制药目的：建立抗生素微生物检定标准操作规程范围：抗生素类药依据：《中国药品检验标准操作规程》2010年版责任：化验员严格按操作规程操作班组长对检验人员的操作进行监督和指导中心化验室主任对检验人员进行培训考核，并对检验人员操作进行监督和指导内容：1 术语或定义本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
2 程序2.1 操作前准备2.1.1 抗生素管碟测定法2.1.1.1 仪器与用具操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。
半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100～10000级）及空调设备，控制室温度在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。
操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。
注意操作，避免室内抗生素污染。
双碟内径约90mm高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
陶瓦盖内径约203mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。
钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端平坦，管壁厚薄一致。
每次使用后应置1:1000新洁尔灭溶液内，浸泡2h以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30min 后用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150～160℃干热灭菌2h，备用。
钢管放置器有6孔和4孔两种。
放置于无菌或半无菌的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。
第七章 抗生素微生物检定法
2
管碟琼脂扩散法
抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试 验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现
透明的抑菌圈。
3
该法根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂 量与抑菌圈的直径或面积呈线性关系，通过比较 标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试 品的效价。
8
（2）三剂量法
取双碟六个，在每个双碟内间隔的3个不锈钢管中 分别滴加高、中及低浓度的标准液，其余两个不锈 钢管中分别滴加高、中及低浓度的供试品溶液。三 个浓度的剂距比为1：0.8。35-37℃ 培养14-16h， 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
9
7、结果判定
实验计算所得效价低于估计效价的90%或高
16
无菌检查法
3、随机抽取2份样品，无菌接种后，
分别在30-35℃和20-25℃培养7日。 4、结果判定： 无菌生长为符合规定。
17
第七章 抗生素微生物检定法 无菌检查法
第一部分 抗生素微生物检定法 第二部分 无菌检查法
1
第一节 抗生素微生物检定法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑 菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 依试验设计原理不同，分为稀释法、比浊法、 琼脂扩散法。 中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。
7
6、检定法
（1）二剂量法 取双碟四个，在每个双碟内对角线2个不锈钢管 中分别滴加高浓度及浓度的标准液，其余两个不 锈钢管中分别滴加高浓度及低浓度的供试品溶液。 高、低浓度的剂距比为2：1或4：1。35-37℃ 培 养14-16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。滴加抗 生素溶液：滴加溶液至钢管口平满，滴加溶液间 隔时间不可过长 。
2015版《中国药典》微生物检验增修订内容
导引图 制剂通则
通用方法/检测方法 指导原则
修订内容概况
2015版药典编制大纲设计方案
------ 附录、药用辅料单独成卷
附录规范统一 附录编号研究 制剂通则修订与完善 通用检测方法的修订与完善 微生物及生物检定附录的修订与完善 指导原则的修订与完善
修订内容概况
取出滤膜接种至培养基，或将培养基 加入到滤筒….。培养3~5天。
薄膜 过滤 法
直接 接种 法
取硫乙醇酸盐流体培养基6管，金葡、 大肠、生孢各接种2管；取胰酪大豆胨 液体培养基6管，枯草、白念、黑曲霉 各2管。
分子生物学技术 生物检查法
1200系列
2000系列 3000系列
生物活性测定法
中药相关检测方法 生物制品相关检测方法
8000系列 9000系列
试剂与标准物质 指导原则
修订内容概况
光 谱 检 测 方 法 的 合 并
修订内容概况
色 谱 检 测 方 法 的 合 并
修订内容概况
微 生 物 检 查 法 的 合 并
非无菌产品微生物限度标准（1107）
抑菌效力检查法（1121）
微生物检查修订情况
指导原则
非无菌药品微生物限度检查指导原则（9202） 药品微生物实验室质量管理指导原则（9203） 微生物鉴定指导原则（9204） 受控洁净环境的监控指导原则（9205） 无菌检查用隔离系统验证指导原则（9206）
应定期按照医药工业洁净室（区） 照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测 试方法的现行国家标准进行洁净 度确认。隔离系统应定期按相关 菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进 行洁净度验证。隔离系统按相关要求进行 验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检
中国药典微生物检验增修订内容及检查要点
中国药典微生物检验增修订内容及检查要点•中国药典微生物检验有关内容及增修订情况–中国药典2010年版微生物检验有关内容–中国药典微生物检验增修订情况•与微生物检验有关的GMP检查要点–微生物检验的关键质量控制点–现行版GMP中与微生物检验有关的条款及检查关注点中国药典微生物检验有关内容及增修订情况•中国药典2010年版微生物检验有关内容–无菌检查法–微生物限度检查法–灭菌法–新增了四个指导原则•抑菌剂效力检查法指导原则•药品微生物实验室规范指导原则•微生物限度检查法应用指导原则•药品微生物检验替代方法验证指导原则无菌检查法•前言部分•培养基•灵敏度检查•稀释液、冲洗液等•方法验证•薄膜过滤法•培养及观察•结果判断•表1、表2和表3•前言部分–规定了防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出–规定了日常检验还需要对环境进行监控–对无菌检查的人员资质提出了要求•培养基–删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧菌的规定–删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定•灵敏度检查–修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法，规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液稀释–规定了稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限“菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
”•稀释液、冲洗液等–规定可根据供试品的特性，选用其他经验证的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液•方法验证–标准菌种的选择上，删除了铜绿假单胞菌，增订了大肠埃希菌–明确规定了薄膜过滤法验证时，应取每种培养基规定接种的供试品总量用于过滤•薄膜过滤法–增订了抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜的规定–对每片滤膜的总冲洗量进行了规定，不得过1000ml–修订了无菌气（喷）雾剂供试品的检验方法，规定冰室的温度应至少为-20℃–对装有药物的注射器供试品的检验方法进行了详细的规定•培养及观察–对于培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长的情况，删除了可划线接种于斜面培养基上的规定，同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判断的规定•结果判断–增订了阳性对照管和阴性对照管的实验结果对于整体实验结果判断的作用“阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。
抗生素微生物检定法
3.1管碟法的操作步骤
菌层的制备： 菌层培养基：在培养基 中添加一定量的菌悬液， 振摇混匀。注意菌层培 养基温度；根据预试验 确定加入菌层培养基的 菌液量。 每只双碟加入5ml菌层 培养基。 注意制备菌层的速度和 平整度。
3.1管碟法的操作步骤
滴加抗生素溶液：
注意标准品、供试品高、低剂量 溶液滴加顺序，保证滴加速度和加 量的均匀一致。每组双碟至少为8 个，一般为10个。 在每个双碟的4个钢管中，对角 的两个钢管分别滴加高浓度和低浓 度的标准品溶液，其余两个对角位 置的钢管分别滴加相应的高、低浓 度的供试品溶液。 按SH→TH→SL→TL顺序，分别 滴加标准品和供试品高、低剂量溶 液。
分相同的标准品与供试品在一定剂量范围内 产生的两条剂量反应直线相互平行，符合量 反应平行线原理的基本要求。
2.原理－量反应直线
两位微生物学者Hamphrey Light和Brown推
导出的琼脂球面扩散动力学公式：
r 4DTlnM / H ln C' ln4DT
2
该方程奠定了管碟法量反应直线公式的基础。
生素液体培养基中的生长情况，利用分光光
度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基
的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法，
可用于抗生素药物的含量（效价）测定。
1.定义－（琼脂）扩散法
通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试
验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产
生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的
方法，多用于抗生素药物的含量（效价）测 定。
可靠性测验计算：
试品间 F1= 0.5326 P=0.05 F= 4.2600 回 归 F2= 873.2370 P=0.01 F= 7.8200 偏离平行F3= 0.2537 P=0.05 F= 4.2600 剂 间 F6= 291.3411 P=0.01 F= 4.7200 碟 间 F7= 2.1653 P=0.01 F= 3.6700
【抗生素精品课件】抗生素微生物检定法
悬液 的制
方法
备
⑤供试品溶 液的制备
④标准品溶 液的制备
学习目标 复习提问
类别 实验菌 培养基 PH
链、卡 枯草芽胞杆 Ⅰ
7.8-
庆、红 菌
8.0
新课大纲 新课内容 本课小结
四、土 滕黄八叠球 Ⅱ 氯、林 菌
6.56.6
课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容
牛肉浸 酵母浸 出粉 1.5g 出粉3g 胨5g
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
三、管碟法
T2
S1
S2
T1
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
1.理论依据：
• 扩散现象：由球面扩散动力学公式表 示
• 相当于直线方程：y=bX+c • 抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈
直径的大小呈直线关系，来测定抗生 素抗菌活性。
2.影响因素?
学习目标
Ⅰ超净工作台
复习提问 Ⅱ抑菌圈测量仪
新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
Ⅲ双碟 Ⅳ陶瓦盖 Ⅴ钢管
Ⅻ试验菌
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
• 管碟法分为三种方法 一剂量法又称 标准曲线法，常用于原料生产的过程 监控、中间体或半成品检验；二剂量 法是抗生素质量检验的常规方法；三 剂量法主要用于标准品的标定。中国 兽药典（2005年版）收载了二剂量法 和三剂量法。
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容
鉴别
随着对动物保护意识提高，对实验动物 减少、替代、优化（3R：Reduction、 Replacement、Refinement）的实施，对 能用理化测定的药品，生物效价测定逐 渐降为鉴别项的定性或半定量测定。 如USP升压素大鼠血压升高法用于鉴别。 2010年中国药典缩宫素注射液将子宫收 缩法放入鉴别项。
建立方法时对鲎试剂及样品的要求
同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂
每个品种至少三批样品（上市品种应检 测两个以上生产厂家；新药需检测连续 生产的样品）。
确定内毒素限值
一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药 剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。 儿童用药如大于成人，以儿童为准。 为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病 等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当 调整，严格至计算限值的1/2或1/3。 对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品 种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品 种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表 示。 对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒 素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计 算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的 是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。
附录增修订主要特点
充分验证：
遵循科学性、合理性、可操作性，新 建或新设立项目必须经不同实验室的 共同验证或适用性研究，如注射剂安 全性指导原则对方法学的适用性研究； 中药生物活性指导原则要求对方法的 专属性、准确性、精密度（重复性、 中间精密度、重现性）、适用性、科 学性进行了研究。
抗生素微生物检定标准操作规程完整
抗生素微生物检定标准操作规程1 简述抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。
后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。
中国药典也采用这两种方法。
抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度围，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基，混均后，经培养，测量培养基浊度。
此法系根据抗生素在一定的浓度围，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。
抗生素效价以“单位（u）”或“微克（µg）”表示。
抗生素管碟测定法2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。
半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级～10，000级）及空调设备，控制室温在20～25℃之间，达到无菌或半无菌状态。
操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。
注意操作，避免室抗生素污染。
2.2 双碟径约90mm，高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一白纸，碟加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，至150℃～160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
微生物限度检查法修订专家讲座
微生物限度检查法修订
第28页
• 微生物程度检验法.pdf
微生物限度检查法修订
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4、修订了菌落培养和计数时间
• 培养和计数 除另有要求外，细菌培养48小 时3天，逐日点计菌落数，普通以48小时3 天菌落数汇报；霉菌、酵母菌培养72小时5 天，逐日点计菌落数，普通以72小时5天菌 落数汇报；必要时，可适当延长培养时间 至5～7天进行菌落计数并汇报。
• 若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未 见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未 检出白色念珠菌。
微生物限度检查法修订
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二、修订内容
• 1、修订了控制菌培养温度 • 控制菌培养温度由35～37℃修订为30～
35℃。 • 此项修订不妥，原因：版控制菌增加了白
色念珠菌，此菌为酵母菌，培养温度为 23～28℃。
年版微生物程度检验法 增 修订内容介绍
——以《中国药典》一部为例
.10
微生物限度检查法修订
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一、增加内容
• 1、增加了贴剂 微生物检验方法 • 检验方法： • 取要求量供试品，去掉贴剂保护层，放置在无菌
玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜无菌多孔 材料（如无菌纱布）覆盖贴剂粘贴面以防止贴剂 粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活 剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀释剂中，用力振 荡最少30分钟，或以其它方法制备成供试液。贴 膏剂应采取薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌 计数。
微生物限度检查法修订
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10、增加了控制菌检验用培养基 适用性检验
• 培养基抑制能力检验：划线接种试验菌 （见表2）于被检培养基平板上，在对应控 制菌检验要求培养温度和时间下培养，试 验菌应不得生长。
微生物限度检菌检验用培养基 适用性检验
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该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
（4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供 试品与标准品不同质。
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
抗生素抑菌效力的测定 抗生素效力的测定方法
及临床药敏试 验等方面
2．微生物效价测定法国内外药典的比较
• 美国药典28版 • 英国药典2002版 • 欧洲药典2002版 • 日本药局方XIV版 • 中国药典2005版
3．微生物效价测定法的操作要点
3.1．管碟法 ➢ 基本原理 ➢ 检定的影响因素 ➢ 效价测定基本操作及注意事项 ➢ 操作要点 ➢ 方法的特点 ➢ 菌种的传代
下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生 素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效
成分效力的方法。
1．2．微生物检定方法
1．2．1. 概述
抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的 抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至 今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着 HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品 种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以 下的原因，抗生素微生物检定法目前在各国药 典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不 可能取代微生物检定法：
1．2．2．抗生素微生物检定法分类
抗生素微生物检定法可分为： （1）稀释法 （2）比浊法 （3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。 目前各国药典通常采用后两种方法测定抗生素
的效价。
1．2．3. 抗生素微生物检定方法比较：
相同点 不同点
目的 应用
稀释法
比浊法
琼脂扩散法
标准品、供试品抗菌效力的比较
➢ 抗生素抑菌圈大小受浓度、加样量、最低抑菌浓 度、扩散系数、扩散时间、培养基的厚度的影响
➢ 当抗生素浓度不变时，加样量的对数与抑菌圈直 径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体 积应一致。钢管（截面积，高度）的大小（重量、 直径、高度）应严格控制。
➢ 抑菌圈大小受抗生素扩散时间的影响，故预先延 长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。
（1）微生物检定法可直观、特异地反应出抗 生素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
（2）多组分抗生素由于不同活性组分生物活 性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组 成、含量和活性的关系；
（3）许多抗生素品种由于各种原因目前没有 适当的化学分析方法表征其活性；
（4）同时微生物法所需仪器设备简单，成本 低。
➢ 双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染；
➢ 试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温 度过高，将检定菌烫死等；
➢ 稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也 可影响抑菌圈的圆整，如氨基糖苷类抗生素，当 缓冲液的pH值偏低、盐浓度偏高时，会出现无抑 菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。
（2） 抑菌圈大小的控制
3.1.1．原理：
利用抗生素在摊布待定试验菌的琼脂培养基 中扩散，形成一定浓度的含抗生素的球型区， 抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基， 可观察到透明的抑菌圈；并且在一定的抗生素 浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈的面 积或直径成正比。
管碟法的基本公式
根据两位微生物学者Hamphrey Light和 Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式：
（1）标准品和供试品内在质量的不同所致。如多 组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌 活性物质的量与供试品有所不同，可使量－反应平 行线不平行。
（2）用于制备标准品溶液和供试品溶液的缓冲液 pH、盐浓度的差异。
（3）供试品制剂中含有维生素、氨基酸、无机盐 及糖类等生长物质，导致在低营养条件的培养基上 影响细菌的生长速率。
量－反应平行线原理：
定义： 当抗生素浓度的对数剂量和反应
呈直线关系，且供试品和标准品的 作用性质相同时，供试品和标准品 的两条量－反应关系曲线相互平行。
3.1.2．检定的影响因素：
3.1.2.1. 标准品与供试品的同质性
抗生素效价测定依据的原理是量－反应平行线 原理，即标准品与供试品的剂量反应直线是相 互平行的，若不平行，则斜率不等，计算结果 将产生较大的误差。造成二者不平行的原因：
等量的试验菌菌液在不同浓度的抗 不同浓度的抗生素溶液
生素液体培养基中的生长情况
在 含 有 试 验菌 固体 培养
基中的扩散情况 含不同浓度抗 用光度法测定 含不 测定不同浓度的抗生素 生素的液体培 同浓度的抗生 素的 溶液在固体培养基表面 养基中有无细 液体培养基的浊度 产生的抑菌圈大小
菌生长 抗生素最低抑 菌 浓 度 (MIC) 的测定 用于新药研制