抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点
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（4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供 试品与标准品不同质。
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
➢ 抗生素抑菌圈大小受浓度、加样量、最低抑菌浓 度、扩散系数、扩散时间、培养基的厚度的影响
➢ 当抗生素浓度不变时，加样量的对数与抑菌圈直 径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体 积应一致。钢管（截面积，高度）的大小（重量、 直径、高度）应严格控制。
➢ 抑菌圈大小受抗生素扩散时间的影响，故预先延 长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。
➢ 双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染；
➢ 试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温 度过高，将检定菌烫死等；
➢ 稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也 可影响抑菌圈的圆整，如氨基糖苷类抗生素，当 缓冲液的pH值偏低、盐浓度偏高时，会出现无抑 菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。
（2） 抑菌圈大小的控制
等量的试验菌菌液在不同浓度的抗 不同浓度的抗生素溶液
生素液体培养基中的生长情况
在 含 有 试 验菌 固体 培养
基中的扩散情况 含不同浓度抗 用光度法测定 含不 测定不同浓度的抗生素 生素的液体培 同浓度的抗生 素的 溶液在固体培养基表面 养基中有无细 液体培养基的浊度 产生的抑菌圈大小
菌生长 抗生素最低抑 菌 浓 度 (MIC) 的测定 用于新药研制
r2 4DTlnM / Hln C'ln4DT
该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
（1）标准品和供试品内在质量的不同所致。如多 组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌 活性物质的量与供试品有所不同，可使量－反应平 行线不平行。
（2）用于制备标准品溶液和供试品溶液的缓冲液 pH、盐浓度的差异。
（3）供试品制剂中含有维生素、氨基酸、无机盐 及糖类等生长物质，导致在低营养条件的培养基上 影响细菌的生长速率。
3.1.1．原理：
利用抗生素在摊布待定试验菌的琼脂培养基 中扩散，形成一定浓度的含抗生素的球型区， 抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基， 可观察到透明的抑菌圈；并且在一定的抗生素 浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈的面 积或直径成正比。
管碟法的基本公式
根据两位微生物学者Hamphrey Light和 Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式：
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度
抑菌圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
量－反应平行线原理：
定义： 当抗生素浓度的对数剂量和反应
呈直线关系，且供试品和标准品的 作用性质相同时，供试品和标准品 的两条量－反应关系曲线相互平行。
3.1.2．检定的影响因素：
3.1.2.1. 标准品与供试品的同质性
抗生素效价测定依据的原理是量－反应平行线 原理，即标准品与供试品的剂量反应直线是相 互平行的，若不平行，则斜率不等，计算结果 将产生较大的误差。造成二者不平行的原因：
1．2．2．抗生素微生物检定法分类
抗生素微生物检定法可分为： （1）稀释法 （2）比浊法 （3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。 目前各国药典通常采用后两种方法测定抗生素
的效价。
1．2．3. 抗生素微生物检定方法比较：
相同点 不同点
目的 应用
稀释法
比浊法
琼脂扩散法
标准品、供试品抗菌效力的比较
下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生 素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效
成分效力Байду номын сангаас方法。
1．2．微生物检定方法
1．2．1. 概述
抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的 抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至 今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着 HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品 种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以 下的原因，抗生素微生物检定法目前在各国药 典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不 可能取代微生物检定法：
（1）微生物检定法可直观、特异地反应出抗 生素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
（2）多组分抗生素由于不同活性组分生物活 性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组 成、含量和活性的关系；
（3）许多抗生素品种由于各种原因目前没有 适当的化学分析方法表征其活性；
（4）同时微生物法所需仪器设备简单，成本 低。
抗生素抑菌效力的测定 抗生素效力的测定方法
及临床药敏试 验等方面
2．微生物效价测定法国内外药典的比较
• 美国药典28版 • 英国药典2002版 • 欧洲药典2002版 • 日本药局方XIV版 • 中国药典2005版
3．微生物效价测定法的操作要点
3.1．管碟法 ➢ 基本原理 ➢ 检定的影响因素 ➢ 效价测定基本操作及注意事项 ➢ 操作要点 ➢ 方法的特点 ➢ 菌种的传代
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
➢ 抗生素抑菌圈大小受浓度、加样量、最低抑菌浓 度、扩散系数、扩散时间、培养基的厚度的影响
➢ 当抗生素浓度不变时，加样量的对数与抑菌圈直 径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体 积应一致。钢管（截面积，高度）的大小（重量、 直径、高度）应严格控制。
➢ 抑菌圈大小受抗生素扩散时间的影响，故预先延 长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。
➢ 双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染；
➢ 试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温 度过高，将检定菌烫死等；
➢ 稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也 可影响抑菌圈的圆整，如氨基糖苷类抗生素，当 缓冲液的pH值偏低、盐浓度偏高时，会出现无抑 菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。
（2） 抑菌圈大小的控制
等量的试验菌菌液在不同浓度的抗 不同浓度的抗生素溶液
生素液体培养基中的生长情况
在 含 有 试 验菌 固体 培养
基中的扩散情况 含不同浓度抗 用光度法测定 含不 测定不同浓度的抗生素 生素的液体培 同浓度的抗生 素的 溶液在固体培养基表面 养基中有无细 液体培养基的浊度 产生的抑菌圈大小
菌生长 抗生素最低抑 菌 浓 度 (MIC) 的测定 用于新药研制
r2 4DTlnM / Hln C'ln4DT
该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
（1）标准品和供试品内在质量的不同所致。如多 组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌 活性物质的量与供试品有所不同，可使量－反应平 行线不平行。
（2）用于制备标准品溶液和供试品溶液的缓冲液 pH、盐浓度的差异。
（3）供试品制剂中含有维生素、氨基酸、无机盐 及糖类等生长物质，导致在低营养条件的培养基上 影响细菌的生长速率。
3.1.1．原理：
利用抗生素在摊布待定试验菌的琼脂培养基 中扩散，形成一定浓度的含抗生素的球型区， 抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基， 可观察到透明的抑菌圈；并且在一定的抗生素 浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈的面 积或直径成正比。
管碟法的基本公式
根据两位微生物学者Hamphrey Light和 Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式：
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度
抑菌圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
量－反应平行线原理：
定义： 当抗生素浓度的对数剂量和反应
呈直线关系，且供试品和标准品的 作用性质相同时，供试品和标准品 的两条量－反应关系曲线相互平行。
3.1.2．检定的影响因素：
3.1.2.1. 标准品与供试品的同质性
抗生素效价测定依据的原理是量－反应平行线 原理，即标准品与供试品的剂量反应直线是相 互平行的，若不平行，则斜率不等，计算结果 将产生较大的误差。造成二者不平行的原因：
1．2．2．抗生素微生物检定法分类
抗生素微生物检定法可分为： （1）稀释法 （2）比浊法 （3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。 目前各国药典通常采用后两种方法测定抗生素
的效价。
1．2．3. 抗生素微生物检定方法比较：
相同点 不同点
目的 应用
稀释法
比浊法
琼脂扩散法
标准品、供试品抗菌效力的比较
下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生 素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效
成分效力Байду номын сангаас方法。
1．2．微生物检定方法
1．2．1. 概述
抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的 抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至 今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着 HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品 种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以 下的原因，抗生素微生物检定法目前在各国药 典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不 可能取代微生物检定法：
（1）微生物检定法可直观、特异地反应出抗 生素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
（2）多组分抗生素由于不同活性组分生物活 性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组 成、含量和活性的关系；
（3）许多抗生素品种由于各种原因目前没有 适当的化学分析方法表征其活性；
（4）同时微生物法所需仪器设备简单，成本 低。
抗生素抑菌效力的测定 抗生素效力的测定方法
及临床药敏试 验等方面
2．微生物效价测定法国内外药典的比较
• 美国药典28版 • 英国药典2002版 • 欧洲药典2002版 • 日本药局方XIV版 • 中国药典2005版
3．微生物效价测定法的操作要点
3.1．管碟法 ➢ 基本原理 ➢ 检定的影响因素 ➢ 效价测定基本操作及注意事项 ➢ 操作要点 ➢ 方法的特点 ➢ 菌种的传代