激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜

ZEISS 780操作规程

本设备属于精密设备，操作人员必须提前熟悉其适用范围、结构、性能及其具体操作方法，未经操作培训者不能进行上机操作。通过操作培训的人员必须严格按照仪器管理老师的培训要求及设备使用说明书指定的操作进行工作。

1.开机

提前进行镜检，确保样本无误；查看空调温度、抽湿机湿度和不间断电源工作情况。

1.1开三相稳压电源。注意：先开稳压电源后面的黑色扳手开关①，再按下稳压电源前面的绿色按钮②，如果出现报警声，请马上关闭稳压电源，并报告管理人员。

1.2两分钟以后依次打开电源控制板上的三个开关。先打开主开关MAIN SWITCH

③，再依次打开SYSTEMS/PC④和COMPONENTS⑤开关。注意：各个开关不要同时按下，开机时仪器会进行自检，每按下一个开关，请等待相应的部件自检完毕后再开下一个开关。

1.3打开电脑开关⑨，点击“LSM User”图标，进入桌面；当看到桌面右下角显示“注意安全”图标时，方可点击桌面中央的ZE N软件图标；然后点击“Start System”按钮开启软件。

注意：当桌面右下角始终不显示“注意安全”图标时，不可启动软件。这时把电脑主机左边那台仪器的盖子掀开，按一下“Reset”按钮，等待电脑桌面右下角出现“注意安全”图标。

1.4打开氩离子激光器（若不使用458nm或488nm或514nm激光线则不需要打开）。先打开氩离子激光器正面的开关ON⑥，再顺时针旋转钥匙⑦至“—”的方向，等待绿色指示灯亮起方可开启光路(大约5-10min)。

注意：Ar+激光器在启动后，需要1h左右的预热时间才能进入稳定状态。若闲置时间1h以上，可将激光器扳钮由“laser run”位置扳至“idle power”处⑧，保护激光器，延长使用寿命。

2.找目标

2.1在明场下用Transmitted light找目标，点击①、②、③、④

注意：如果实验只使用空气镜，放置样品后，建议先选择低倍物镜找细胞，再换用高倍物镜微调即可。切记调焦和移动前后、左右的滑竿时，不要太快太猛，以免物镜顶到样品或载物台，这会严重磨损和划花镜头，甚至碰碎镜头！！

切记：显微镜左、右两边的粗准焦螺旋上方各有五个按钮，如果不知道它们各自的功能不要碰触，否则可能关闭明场灯源，无法用眼睛找细胞。

水、油镜使用注意：如需使用水镜或油镜，水、油不要滴太多，以免从镜头边缘流入物镜内部污染镜头。换细胞前后不要反复擦拭镜头，擦拭过多容易磨花镜头，降低透过率，一般两三个样本后再追加一滴水或油即可。实验结束后先用擦镜纸将油擦尽，再用无水乙醇清洁。

2.2在荧光下用Reflected light找目标，先打开汞灯电源，然后点击上图片中的

①、②、⑤、⑥

注意：

一、除非实验转染的荧光蛋白效率稍低（镜检时发光的目标不多，但仍然可以进行试验），否则一般不要开汞灯，汞灯寿命有限。

二、经镜检确定需要使用汞灯的标本，样本放置好后再打开汞灯电源。集中观察，节省时间保护光源；快速寻找目标观察，保护样品不被淬灭。

切记：不可频繁开关汞灯，汞灯点燃后至少15分钟汞蒸汽才完全蒸发，因此打开汞灯后至少要30分钟后才可以关闭汞灯电源，汞灯关闭后不能马上再次打开使用，至少一小时以后等灯泡完全冷却后再开。

3. 激光扫描图像获取：

用眼睛找完细胞以后，要切换到激光扫描模式来获取图像。依次点击上图片中的：

⑦、⑧按钮。切记：从找细胞切换到图象扫描，一定要记得点击⑦，否则容易损坏

仪器。

3.1光路选择设定：

一、新设置光路：点击下图中的Smart Setup按钮，选择自己所用的荧光探针，设

定所需的颜色，然后点击Best signal，点击Apply按钮。

注意：如果使用Ar+激光器,点击Apply前,先确定激光器上的绿色指示灯亮起。

二、使用原来的光路：在File中open之前实验所得的一张图片，点击页面最下方的Resue按钮，此时软件的一切参数均是打开的那张图片的参数。同样注意：如果使用Ar+激光器,点击Apply前,先确定激光器上的绿色指示灯亮

三、自己设置光路：需要知道所使用荧光蛋白或燃料的激发光谱和发射光谱。在下

图Light Path中选择合适的激发光，二色镜，荧光接收波段。

4. 扫描参数设定：

光路设定后，点击上图中的Live按钮，预览找目标。此时可以移动样品，微调焦，调针孔大小，调图像荧光亮度，调透射图T-PMT亮度，调噪音等。调好图像后，点击Live处的红色Stop按钮停止预览，再点击Snap按钮拍照。切记：预览结束后一定要先Stop，再点击Snap,否则很容易死机。

激光器输出功率的调节要注意：激光器的输出功率越高，荧光图像和透射图图像就越亮，但会造成荧光样品的光漂白，长时间扫描或对荧光性质不稳定的染料尤其明显，所以实验中尽量不要把激光器的输出功率调的太高。调节激光器的输出功率时要逐步调节，不要一下子将光标拖到需要的功率，否则容易损坏激光器或AOTF(声光调节滤光片)。

Pinhole的调节要注意：Pinhole越小，图象的分辨率越高，但探测器收集到的荧光也越少，图像亮度就越小，一般先选1AU，如果图像过暗可适当增加。使用多通道（多Track）时,应使每个Track里设置的pinhole大小一致(optical slice一致)，以保证不同通道探测的都是细胞同一层面的荧光；

增益Gain (Master)的调节要注意：Gain (Master)的设置不宜太高，原则上增益不要超过800，同时Gain设置太高也会导致背景过高，降低图象的信噪比。如果信号太弱，可以适当调高放大器的增益（Digital Gain），其默认值为1，例如可以调高到1.5左右（不要超过2）。

背景Digital offset的设定原则: 图象最亮点不超过饱和值256（显示红色），图象背景处的蓝色雪花点不宜太多（蓝色表示信号强度为零）。

注意：准备样品的时候，请将探测通道先关闭（即将Track前的符号“√”去掉），这样高压包上没有加电压，可以起到保护高压包延长寿命的作用。