(干货)液相色谱基础知识大全
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）L、基线漂移原因和解决方法1、柱温波动。
（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
）解决方法：控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图2、流动相不均匀。
（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
）解决方法：使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。
流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
如有需要，可以用1N的硝酸。
（不要用盐酸）4、检测器出口阻塞。
（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）解决方法：取出阻塞物或换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化解决方法：更改配比或流速。
为避免问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时解决方法：用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成解决方法：检查流动相的组成。
使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
解决方法：重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
解决方法：将波长调整至最大吸收波长处M、基线噪音（规则的）原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气解决方法：流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液解决方法：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要，更换泵密封。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
最全的液相色谱知识 整理
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）流动相a、流动相对样品具有一定的溶解能力b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
1.流动相必须用HPLC级的试剂.2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。
种被污染的溶剂如用于HPLC 系统，可能造成柱效降低。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。
因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
液相色谱知识汇总
1.色谱技术概述2.仪器的维护保养3.★仪器故障排除4.★软件操作5.软件安装6.★色谱方法的开发与改进7.★色谱峰的异常解析8.色谱法的技术参数9.色谱柱相关知识1)色谱柱的采购2)色谱柱的活化3)色谱柱的使用4)色谱柱的再生基本概念和理论一、基本概念和术语1．色谱图和峰参数⌝色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线。
又称色谱流出曲线(elution profile)。
⌝基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
⌝噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
⌝漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⌝谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。
⌝色谱峰(peak)——组分流经检测器时由响应的连续信号所产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
⌝拖尾因子(tailing factor，T) ，拖尾因子(tailing factor，T) ，W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d为峰极大至峰前沿之间的距离。
用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
（注意有些软件的计算方法表示不同）《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
⌝峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。
液相色谱的基础知识共69页
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
液相色谱的基础知识
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。 Nhomakorabea•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
END
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识一、液相色谱原理液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。
当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。
通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。
根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。
正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。
在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。
同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
2. 缺点：液相色谱需要使用有机溶剂作为流动相，可能对环境和人体健康造成一定影响。
此外，液相色谱的设备成本较高，操作复杂度也相对较高。
六、液相色谱仪器设备液相色谱常用的仪器设备包括高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、质谱仪等。
其中，高效液相色谱仪是实现液相色谱分离的核心设备，它包括泵、进样器、色谱柱、检测器等部分。
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
最全的液相色谱知识 整理要点
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）流动相a、流动相对样品具有一定的溶解能力b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
1.流动相必须用HPLC级的试剂.2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。
种被污染的溶剂如用于HPLC 系统，可能造成柱效降低。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。
因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
液相色谱基础知识
梯度洗脱形式： 梯度洗脱形式：
线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系
梯度洗脱形式的选择
液相色谱基础知识
梯度洗脱： 梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度，提高检测器的灵敏度
液相色谱基础知识
液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 液相色谱：
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 适用于高沸点、大分子、 分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱： 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 适用于沸点较低、 流动相只起运载样品分子的能力
注意事项： 注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 （如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动 相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
样 品
1.
处
理
使用适宜的流动相溶解样品 在溶剂选择的时候，应注意以下原则： -- 减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰 的流动相 -- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统 中尤其在色谱柱中产生沉淀
溶 剂 等 级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
General Maintenance and Troubleshooting
溶 剂 等 级
缓冲液的使用
使用前必须过滤 以免造成腐蚀、 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用纯水冲洗 首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用 ），再用 阻塞 首先用纯水冲洗 （ ）， 甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 甲醇冲洗 易受到细菌和霉菌的影响
液相色谱基础知识(waters)
H 3 C H 3 C
C H 2
C H 2
C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C
H 2 C H 2 C
C H 2
C H 2
C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C
H 2 C H 2 C
C H 2 H 2 C
H 2 C C H 2 H 2 C C H 2 H 2 C C H 2
H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 3 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 3 C H 3 O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S i O O O S O iO H O S O iO
离子交换柱(钙基/Ca)
用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。 主要用于药厂维生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨 醇/甘露醇)，酒厂(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。
柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要求 用户另置超纯水系统。
T = 1.58 峰面积回收率
97.8 % 95.3 % 92.3 %
Waters 21,379
超越极限：全新Xterra色谱柱
集硅胶与聚合物基质填料的优点为一体,突破常规 高效色谱柱的极限 高效、高速分离
不仅能够使用极小粒径的填料以进行高分辨及快 速分析，而且允许在高温下进行分离
全面的液相色谱知识介绍
意考虑流动相对样品的溶解度；pH范围2~11.5。使用有机缓冲液，浓度以 10~50mM为好。 在中高pH下避免使用磷酸盐， 碳酸盐缓冲液。 分离碱性物质， 所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。 4. 在线保护装置：给色谱柱提供物理的保护，除去样品及流动相中的颗粒；给 色谱柱提供化学的保护，防止分析柱被化学污染；装置方面：在线过滤器、 自装填料保护柱、预装保护柱； 在线过滤器：（我们项目组正在使用） 作用：防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效，在需要高柱效的分析时中常用 保护住：可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在 用微柱时。建议我们项目组也可以采用保护柱。 在线过滤器的清洗：将在线过滤器拆下，浸入20~30%硝酸溶液中，超声15 分钟，取出用水洗净即可，如果使用的是正相系统，注意将滤器烘干。 5. 色谱柱的保存：新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗，所有色谱柱使用缓冲液后 必须用柱体积20~30倍的不含盐流动相冲洗色谱柱；保存色谱柱时用100%甲 醇或乙腈，柱两端必须用接头密封；停用数天后最使用时，应先用低流速甲 醇冲洗1h左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形 不好。短期不用必须冲洗干净后保存，长期不用每隔2~3个月冲洗一次，并 应防止强烈振动，防止细菌生长，注意存放温度。
二、液相色谱仪器系统、液相色谱分离模式及完善方法：论证和移植
1. 液相色谱系统
图5 典型的HPLC仪器示意图 高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数 据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。 （1）进样系统： 一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作， 进样量是恒定的。 这对提高分析样品的重复性是有益的。 （2）输液系统： 该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强 为1.47～4.4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低
液相色谱法基本知识
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利
于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液
相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在 气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而 且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际 应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数（K）或分配比
（k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法 不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。
21
第四节 液—固色谱法
（4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶 剂要不吸收紫外光。
（5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜 等。
在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试 样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种 不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值 范围很广则使用梯度洗脱。
3
第一节 概 述
的70 ~ 80%。 （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作
因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相 互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样 品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同 比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选 择性。 ②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
8
第二节 高效液相色谱仪
液相色谱基础知识
紫外可见检测器
紫外可见检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感
2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
紫外可见检测器
光栅
l
样品池
Ein
Eout
光电管
D2 / W 灯
Ein
Ein
参比池
返回
流动相注意点
离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开
始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用
LC检测器
紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）
返回
流路中形成气泡引起的问题
改变保留时间和峰面积
流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动
峰变形
柱中气泡形成和累积使流动相绕流
尖峰或锯齿状噪声
检测池中气泡形成和累积产生基线噪声
输液泵
输液泵类型： 注射泵 柱塞往复泵 隔膜泵
输液泵控制方式：
恒流控制 恒压控制
柱塞往复泵
马达和凸轮
液相色谱基础知识
一、色谱起源
石油醚
色素
碳酸钙颗粒
色谱
组分
HPLC的分离类型
正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation
mode)
液相色谱基础知识
第一部分原理和分类一、色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLC)。
也称现代液相色谱。
二、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
液相色谱基本常识
提纲
z 回顾上节课 z 高效液相色谱(HPLC）介绍 z HPLC色谱柱 z HPLC色谱方法的开发案例 z 使用注意事项 z HPLC色谱检测器介绍
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色谱法基本原理
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色谱法基本原理
z 色谱法的原理
z 利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用 性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受 到上述各作用力而达到相互分离
球形硅胶:
现代 HPLC 填料 粒径小 (5 µm, 3 µm, <2 µm) 重现性好 稳定性好 分离效率高
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色谱柱的分类
常见的分配柱填料： z 碳十八柱（ODS/C18) z 碳八柱（MOS/C8） z 碳六柱（Hexyl/C6） z 碳四柱（Butyl/C4） z 碳一柱（Methyl/C1） z 阴离子交换柱（SAX) z 阳离子交换柱（SCX） z 苯基柱（Phenyl） z 氨基柱（Amino/NH2） z 氰基柱（Cyano/CN/Nitrile） 常见的吸附柱填料：硅胶柱、氰基柱、氨基柱
z 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),也就是咱 们的色谱材料；有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流 动相又叫洗脱剂,溶剂
z 正相色谱： z 反相色谱： z 色谱定性： z 色谱定量：
色谱的类型
z 按流动相的物态分:
z 气相色谱 (Gas Chromatography, GC)-用气体作为流动相(又叫 载气)
液相色谱柱反相填料作用机理
NH2
Silica base
Bonded functional group (C8)
SO3-
液相色谱柱正相填料作用机理
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一、基本原理
高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理
（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分
离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。
三、工作原理
储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。
四、HPLC的特点和优点
HPLC有以下特点：
高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
五、液相色谱的五大系统
1、进样系统
进样系统分为手动进样阀和自动进样器。
手动进样阀
对于手动进样阀使用过程中需要注意每个样品进样完成后应对进样阀进行清洗，防止残留对下一个样品分析的影响。
还需要注意进样方式，以20μL定量环为例，我们可以选择完全充满定量管或部分充满定量管。
为了保证进样的重复性，选择完全充满定量管进样方式时，需要注入定量环体积3倍以上的样品;选择部分充满定量管进样方式时，进样体积应在定量管体积一半以下，即1-10μL。
自动进样器
如果采用自动进样器进样，首先需要保证注射器里面没有气泡存在，否则影响进样量准确性;其次是样品瓶里面有足够的样品，保证进样针能够吸到样品。
为了避免交叉污染需要定期对样品瓶、盖和垫进行清洗。
若自动进样器长时间不使用，应该注意：腐蚀性的流动相或洗液(例如，碱性或酸性缓冲溶液)必须完全从系统中置换出来。
同时，为了避免细菌的生长，应将一个样品瓶中充满甲醇，并重复几次进样操作。
2、输液系统
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。
对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。
因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。
机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
HPLC使用的高压泵应满足下列条件：
a 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1～10ml/min）；
b 能抗溶剂腐蚀；
c 有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150～300×105Pa。
（1）往复式柱塞泵结构和原理
当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。
反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。
这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。
（2）气动放大泵结构和原理
其工作原理是：压力为p1的低压气体推动大面积（SA ）活塞A，则在小面积（SB ）活塞B输出压力增大至p2的液体。
压力增大的倍数取决于A和B两活塞的面积比，如果A与B的面积之比为50：1 ，则压力为5×105Pa的气体就
可得到压力为250×105Pa的输出液体。
这是一种恒压泵。
泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆.单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成.在压力的作用下宝石球离开阀座,流动相流过单向阀;反之,在反向力的作用下,宝石球回到阀座上,此时流动相不再流过单向阀.显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏.为了保证单向阀不发生泄漏,一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座,也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上.在不同的应用领域,单向阀阀体的材料有所不同,例如考虑生物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛,而不用不锈钢.为了降低成本和减少维护费用,一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件,当然其功能仍保持不变
输液系统即是指高压恒流泵，其作用是能提供稳定准确的流速。
溶剂过滤头：吸液过滤头，或称沉子，主要作用是过滤流动相中可能存在的颗粒性杂质。
长时间使用后，杂质有可能阻塞溶剂过滤头上的过滤板孔隙;或长时间使用缓冲液，过滤头表面容易产生一层膜，阻碍流动相正常通过。
严重时，即使是已超声过的溶剂，泵吸液时也会有气泡在四氟输液管里产生，因此应经常对过滤头进行清洗。
清洗溶剂可以选择乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系统需注意滤头的烘干处理。
单向阀：单向阀的作用是确保液体向一个方向流动，是高压恒流泵稳定输液的保证。
日常使用过程中，可以通过观察压力的情况，初步判断流量是否正常。
如果系统已经平衡一段时间，压力应该是稳定的。
但如果压力存在波动，则表明流量不稳定;如果无压力，则表明无流量。
这两种情况大多是因为单向阀里混入了气泡或杂质。
混入气泡的情况，应把放空阀打开，按冲洗键将里面的气泡排出。
单向阀混入杂质的情况，须对其进行清洗。
清洗溶剂可以选择乙醇，安装时注意标记环的方向。
密封圈：密封圈是固定在柱塞杆上防止泵腔内的液体泄漏，是保证泵头输液正常的关键部件。
但柱塞杆和柱塞密封圈长期使用会发生磨损，主要与流量、操作压力和所使用的流动相有关。
当使用含盐的流动相时，由于脱水或蒸发，可能形成盐结晶，而泵运动时盐结晶会导致密封圈和柱塞杆的磨损。
因此，每天实验前和实验后都需用纯水冲洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二级密封圈之间)，保持清洗管内有水以防止形成晶体，延长柱塞杆和密封圈的使用寿命。
在线过滤器：为了防止由于流动相杂质微粒进入色谱系统，泵在放空阀内安装了在线过滤器，经泵出口流出的液体通过在线过滤器，经排空管流出的。