生物药物分析与检测高效液相色谱法概要

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高效液相色谱分析法剖析课件

高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、可在室温下进行分离、可分析复杂样品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等，保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中的有机污染物，如酚类、苯胺类等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进行适当的预处理，如离心、过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡原理。

高效液相色谱法在药物分析领域中的应用

高效液相色谱法在药物分析领域中的应用摘要：对高效液相色谱法在药物含量测定，药物鉴别及添加违禁药物检查中的应用进行了综述。

并展望了高效液相色谱法的发展一联用技术在药物分析中的应用前景。

关键词：高效液相色谱药物分析应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，hplc）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”等，是一种高压、高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快的分离分析技术，广泛应用于医学、药学、化学、生化、工业、农业、环保、商检和法检等科学领域。

高效液相色谱法适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。

在中国药典中主要用于药物的含量测定、有关物质检查和鉴别等。

1高效液相色谱法在药物含量测定中的应用天然药物的来源有动物、植物和矿物之分。

由于化学成分复杂，有效成分可能有一个，也可以有多个，因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制，建立质量标准具有重要的意义。

高效液相色谱法可对天然药物的成分进行分离鉴定，并测定有效成分的含量。

葛根素是粉葛药材中的主要活性成分之一，具有扩张冠状动脉、降低血压、减少心肌耗氧量、抗心率失常、降血糖、将血脂、抗动脉硬化、改善微循环、抗肿瘤等多种压力作用。

刘宁采用hplc法测定四川粉葛中葛根素的含量，结果显示该法方简单易行，结果准确，可用于四川粉葛药材的质量控制。

重要复方制剂和化学复合制剂通常含有多种有效成分，各有效成分的含量决定了药物的治疗效果。

高效液相色谱法适合分子量大、难气化、对热敏感等物质的分离分析，因此在中药复方制剂和化学复合制剂的分析中得到了广泛的应用。

秦慧丽等采用高效液相色谱法测定了金麦胶囊中绿原酸含量，结果显示该方法测定样品分离度佳、灵敏度高、操作简便、结果准确可靠。

2hplc在药物鉴别中的应用中药材是加工中药饮片和生产中成药的用原料药，其品种的真伪、质量的优劣直接影响到临床用药的安全有效。

论文高效液相色谱在药物分析中的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与发展摘要：色谱分析作为重要的分离分析技术，已成为药物研制开发、生产单位、药品检验部门及医院临床检验等各个领域中药物质量控制必不可少的方法和技术。

高效液相色谱法是20世纪60年代末70年代初出现的分析速度快、分离效率高、操作自动化的新型色谱分析方法。

它已逐渐成为药物分析领域中重要的分析手段及主要制备方式之一。

关键词：高效液相色谱法药物分析1.前言高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography , HPLC），又称“高压液相色谱法”或“高速液相色谱法”，是20世纪60年代末，在经典液相色谱的基础上引入气相色谱的理论与实验方法，并加以改进而发展起来的一种重要分离分析方法。

HPLC采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度在线检测器等技术，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、色柱可以反复使用、流动相可选择范围宽、流出组容易收集、适用范围广和安全等优点，特别适合挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离分析测试，广泛应用于医学、药学、化学、生化、工业、农业、环保、商检和法检等科学领域错误!未找到引用源。

近年来，高效液相色谱法在药物分析中发挥着越来越重要的作用，主要是鉴别相关物质、检查药物中有关物质的含量限度以及测定有效成分或主要成分含量，世界各国已将该法收载于药典。

本文就高效液相色谱法在药物分析研究中的应用和发展综述如下。

2.高效液相色谱法在药物分析中的应用2.1高效液相色谱法在药物鉴别中的应用在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数，可用于药物的鉴别。

如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。

头孢拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。

王维剑[7]王维剑,张军仁,庞华.替莫唑胺含量测定方法的研究[J].药物分析杂志,2003 ,23 (5) :344.等以ODS柱，甲醇-0.5%乙酸(1:9)为流动相，DVD检测器，波长329 nm测定了一种新型抗肿瘤药替莫唑胺(temzolo-mide)，为申报新药提供了数据。

高效液相色谱法及其在药物分析中的应用(最新整理)

高效液相色谱法及其在药物分析中的应用以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。

用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。

高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。

与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。

目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。

下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。

一、分类高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。

使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。

在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。

组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。

流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。

（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。

目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。

键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。

按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。

生物药物分析与检验高效液相色谱

背景

色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett 发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC）等。
色谱法的分类

按流动相状态的不同，可分为气相色谱法 (GC) 液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱 (SFC)
7
什么是气相色谱法？

以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatography，简称GC 适合分离分析易汽化（在- 190℃-500℃范围内有 0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。
25
检测原理：朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=lg(1/T)=Kbc 特点：灵敏度较高（10-6-10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长
2．流动相
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。
正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。

高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。

以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。

于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。

鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。

随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。

高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。

1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。

②高效：分离效能高。

可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。

④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。

⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。

高效液相色谱有5种类型：1、吸附色谱（Adsorption Chromatography）2、分配色谱（Partition Chromatography）3、离子色谱（Ion Chromatography）4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）5、亲和色谱（Affinity Chromatography）此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点。

高效液相色谱基础知识总结

高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究（包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离

高效液相色谱法检测重均分子量_概述及解释说明

高效液相色谱法检测重均分子量概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文主要介绍了高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）在检测重均分子量方面的应用。

重均分子量是指聚合物中各个单体单位的平均摩尔质量，对于聚合物的性能评价尤为重要。

而HPLC作为一种常用的分离和分析方法，具有分离精度高、检测灵敏度高、操作简便等优点，在聚合物领域得到了广泛应用。

1.2 文章结构本文共分为五个部分，包括引言、高效液相色谱法检测重均分子量、实验操作与结果分析、结果讨论与展望以及结论。

引言部分将介绍文章的研究背景和目的，以及文章的结构安排。

随后的各个章节将详细介绍HPLC检测重均分子量的原理、方法步骤和应用领域，并通过实验操作与结果分析进行验证和解释。

最后，在结果讨论与展望部分对实验结果进行深入剖析，并探讨其发展前景和应用推广建议。

结论部分则总结了主要发现和研究意义，同时指出了研究的不足之处和改进方向。

1.3 目的本文旨在全面概述高效液相色谱法在检测重均分子量方面的应用，并探究其优势、方法步骤和应用领域。

通过实验操作与结果分析，验证HPLC在重均分子量检测中的可行性和准确性，并对实验结果进行深入讨论和展望，为相关领域的研究与开发提供参考。

本文的撰写旨在促进对HPLC技术在聚合物领域中的应用和推广，并对未来研究方向提出建议，以推动该领域更加深入细致的研究及产业化发展。

2. 高效液相色谱法检测重均分子量:2.1 原理介绍:高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的化学分析技术，它利用样品在流动液相中的分配行为与固定的固定相之间的相互作用来实现分离和检测。

而重均分子量是指聚合物样品中各个单体单位重量的平均值，是衡量聚合物链长度及其分布的一个重要参数。

因此，高效液相色谱法可以用来准确快速地测定聚合物样品的重均分子量。

高效液相色谱在药物分析中的应用

高效液相色谱在药物分析中的应用一、引言药物分析是指对药物化学和药物控制的分析研究，其目的是确定药物的成分、结构、性质，以及在制剂中的含量、纯度和稳定性等指标。

高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，凭借其高分离效率、高灵敏度和宽泛的应用范围，被广泛应用于药物分析领域。

二、HPLC的原理与优势HPLC是在高压下进行的液相色谱技术，其原理是通过将样品在高压下推动通过色谱柱，利用不同成分在固定相上的相互作用力差异，实现样品组分的分离。

HPLC相比传统的液相色谱技术有许多优势，包括分离效率高、分析时间短、样品消耗少、操作简便快捷等。

三、药物分析中的HPLC应用1. 药物成分分析药物成分分析是药物分析的核心内容之一，HPLC在药物成分分析中具有广泛的应用。

通过HPLC技术，可以准确测定药物中各种成分的含量及相对含量，为药物的质量评价提供客观依据。

此外，HPLC还能有效地分析药物中的杂质，保证药物的质量和安全性。

2. 药物代谢产物分析药物在人体内经过代谢作用形成代谢产物，其研究对评价药物的药效和副作用至关重要。

HPLC作为一种灵敏的定性和定量分析方法，被广泛应用于药物代谢产物分析。

通过HPLC技术，可以对代谢产物进行定性的鉴定，并确定其在体内的生成和消除动力学过程，进一步探索药物的药效和副作用。

3. 药物制剂质量控制药物制剂质量控制是指对药物制剂中有效成分的含量、纯度和稳定性等指标进行分析研究。

HPLC作为一种高分辨率、高效率的分离技术，可用于测定药物制剂中的有效成分含量。

通过HPLC 技术，可以准确测定药物制剂中各种成分的含量，确保药物制剂的质量符合规定标准。

4. 药物毒物分析药物毒物分析是指对药物中的毒性物质进行鉴定和测定，以评估其对人体的安全性。

HPLC作为一种高度灵敏和选择性的分析技术，在药物毒物分析中具有重要的地位。

通过HPLC技术，可以对药物中的毒性物质进行准确的分离和定量，为评价药物的安全性提供重要依据。

高效液相色谱(文献综述)

高效液相色谱结合化学发光的简要介绍（孙鑫环境学院Z1009006）摘要：目前，高效液相色谱(HPLC)法由于对复杂样品中的分析物具有极高的分离效率而成为最有效的分离方法。

将具有高灵敏度的化学发光分析法和具有高分离效率的高效液相色谱分离法相结合已引起了国内外分析化学家的极大兴趣。

本文简单概述了高效液相色谱化学发光的特点、发展史、检测原理、化学发光反应体系以及发展前景。

1.引言高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是一种具有高效、快速及应用广泛的现代分离技术，它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及较高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法己经成为有机物质分析的支柱技术，在生物化学、临床医学、食品检验、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用，成为分析化学家和生物化学家用以解决他们面临各种实际分析和分离必不可缺的工具。

与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。

高效液相色谱仪是由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

从上个世纪70年代以来，人们经过努力已研究和开发了多种检测器，如紫外-可见光检测器(UV一Vls)、光电二极管阵列检测器(PDA)、荧光检测器(FLD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、蒸发激光散射检测器(ELSD)、光电导检测器(PCD)、磁旋光检测器(MDR)、放射性检测器(RD)、热离子化检测器(TID)、化学发光检测器(CLD)和质谱(Ms)检测器等等。

随着色谱技术的发展，结合计算机各种软件的开发，使HPLC与各种检测仪器联用。

高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展

高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展一、概述高效液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于药物分析的重要技术，具有快速、高效、灵敏度高和分辨率高等特点。

自20世纪70年代以来，随着色谱理论和仪器技术的不断发展，HPLC已成为药物分析领域中不可或缺的工具。

其利用不同物质在固定相和流动相之间的分配差异，通过高压泵将流动相推动通过装有固定相的色谱柱，实现样品中各组分的分离。

随后，通过检测器对分离后的组分进行检测，从而实现对药物成分的定性和定量分析。

近年来，随着药物分析需求的不断提高，HPLC在药物分析中的应用研究也取得了显著的进展。

在药物质量控制方面，HPLC可用于药物有效成分的含量测定、杂质含量的检测以及药物制剂中各组分的分离分析等。

HPLC还可应用于药物代谢产物的分析，为药物研发提供重要的参考信息。

在药品检验中，HPLC的应用不仅提高了检验的准确性和效率，还有助于实现药品检验的自动化和智能化。

同时，随着HPLC技术的不断发展，其在药物分析中的应用也将不断拓展和完善。

本文旨在综述HPLC在药物分析中的应用研究进展，为相关领域的研究和实践提供参考和借鉴。

1. 高效液相色谱技术简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种重要的色谱分析技术，广泛应用于化学、医学、工业、农学、商检和法检等多个学科领域。

作为色谱法的一个重要分支，HPLC以液体为流动相，通过高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱。

在柱内，各成分因与固定相发生作用的大小、强弱不同，而在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，进入检测器进行检测，实现对试样的分析。

HPLC具有“四高一广”的特点，即高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。

高压是因为流动相为液体，流经色谱柱时受到的阻力较大，需要高压泵来推动流动相通过色谱柱。

HPLC

高效液相色谱法

2 仪器组成高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
高效液相色谱法

泵
洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实现程序控制。
高效液相色谱法

进样器手动进样器(六通阀式进样器) 自动进样器：在程序控制器或微机控制下，可自动进行取样、进样、清洗等一系列动作，有几种比较典型的自动进样装置：圆盘式自动进样器、链式自动进样器、坐标式自动进样器等，操作者只需将样品按顺序装入贮样室内即可。
高效液相色谱法
④包覆聚合物(Polymer encapsulated) 包覆聚合物是在无机载体如硅胶、石墨化碳或氧化锆的表面形成固载化的有机聚合物薄层，聚合物薄层表面还可键合上C18、 C8、NH2、CN等，色谱过程中仅聚合物层与流动相和组分接触，因而兼顾了无机载体的刚性和有机聚合物的化学稳定性。
高效液相色谱法

3、电化学检测器(Electrochemical detector，ECD)：电化学检测器是测量物质的电信号变化，对具有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化学检测器。包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化合物的检测，电导检测器主要用于离子检测。其中安培检测器(amperometric detector，AD)应用较广泛，更以脉冲式安培检测器最为常用。
高效液相色谱法
缺点：只适用于能够产生荧光的物质的检测，适用范围不如紫外检测器。影响因素较多，对溶剂的纯度、pH值、样品浓度、检测温度等需很好地控制。适用范围：具有天然荧光的物质可以直接检测，也可通过荧光衍生化使原本没有荧光的物质转变成荧光衍生物后测定，从而扩大了荧光检测器的适用范围。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。

中国药典高效液相色谱讲义

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英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器和自动积分仪。
仪器包括：储液器泵进样器色谱柱检测器
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色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
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分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。

高效液相色谱法原理

高效液相色谱法原理
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用的分离和分析方法，其原理基于样品中的
化合物在液相流动载体中与固定在填料上的固定相相互作用，并因此在色谱柱上发生不同程度的分配和保留。

在高压下，样品通过色谱柱，各组分依据其与移动相和固定相的相互作用的不同，在柱中以不同速率进行分离。

高效液相色谱法的主要组成部分包括进样器、色谱柱和检测器。

样品首先通过进样器注入到移动相中，然后进入色谱柱。

色谱柱是由一种固定相填充而成的管状结构，固定相表面有一定数目的固定相基团，用于化合物的分离。

移动相则是一种液态溶剂，可以根据需要选用不同的组合，并通过高压泵以一定流速通过色谱柱。

化合物在色谱柱中与固定相发生相互作用，有选择性地被保留或分离。

不同的化合物在色谱柱中的相互作用程度不同，因此它们以不同的速率通过色谱柱。

通过控制柱温、移动相成分、流速和色谱柱填料等条件，可以调节分离效果。

最后，分离的化合物进入检测器进行检测和信号记录。

高效液相色谱法广泛应用于许多领域，包括药物分析、环境监测、食品安全等。

其优点在于对大多数化合物具有良好的分离选择性、灵敏度高、分析速度快、操作简便。

同时，该方法还可以与其他分离技术（如质谱联用）进行联用，以提高分析的灵敏度和准确性。

中国药典-高效液相色谱

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分离度(R)

用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。
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二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）
特点：在任一时间内，均可同时得到
物质在不同波长下的吸收情况，即三
维图谱
多组分混合物的三维图谱
流动相

反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
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ห้องสมุดไป่ตู้

正文规定的定量方法如果不是内标法，建议用固定体积的定量环进样器；色谱柱通常为不锈钢柱，其尺寸规定在正文中（长度和内径）；正文中规定的固定相如以字母表示，即指本节所附的固定相，该固定相的粒度在字母后的括号内写明，有时标明适用牌号，并不等于别的牌号不能用。本节所附的固定相有：固定相A为硅胶颗粒，固定相B为表面化学键合辛烷基硅烷的硅胶颗粒，固定相C为表面化学键合十八烷基硅烷的硅胶颗粒。除另有规定外，色谱分离是在恒定的室温下进行，光度检测器的流通池体积以10ul为宜。对色谱条件的变更未作详细说明，但说明了分析工作者改变色谱条件，应能得到与要求一致的结果。溶剂和试剂的质量应适于液相色谱法的应用。

高效液相色谱法分离纯化生物制剂分析方法

高效液相色谱法分离纯化生物制剂分析方法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用于生物制剂分析的分离纯化方法。

本文将详细介绍高效液相色谱法在生物制剂分析中的应用，包括样品准备、色谱条件的选择以及结果的解读等方面。

在生物制剂分析中，样品准备是非常重要的一步。

首先，样品应进行必要的预处理，如去除杂质、防止蛋白质的降解等。

其次，对于复杂样品，可以采用固相萃取、超滤等技术进行样品的富集。

最后，样品的pH值和盐度等参数的调整也是非常关键的，以保证色谱分离的效果。

在选择色谱条件时，需要考虑到生物制剂的性质以及所需分离的目标成分。

首先，选择合适的色谱柱是关键。

常用的色谱柱有反相柱、离子交换柱、凝胶过滤柱等。

反相柱适用于疏水性物质的分离，离子交换柱适用于带电物质的分离，凝胶过滤柱适用于小分子与大分子的分离。

其次，选择合适的溶剂体系和梯度程序也是非常重要的。

溶剂的选择应结合样品的溶解度和色谱柱的性质，通常采用的溶剂有水、乙腈和甲醇等。

梯度程序的选择可以根据目标成分的分离程度进行调整，以获得最佳的分离效果。

在高效液相色谱法分离纯化生物制剂的过程中，结果的解读也是一个关键环节。

首先，要对色谱波峰进行鉴定和定性分析。

可以利用标准品进行鉴定，通过比对保留时间和紫外吸收光谱等信息。

其次，要对波峰进行定量分析。

可以利用内标法、外标法或者定量标准品法进行定量计算。

最后，对结果进行统计分析，比较不同样品之间的差异，评估分析方法的准确性和可重复性。

除了以上描述的基本步骤，高效液相色谱法在生物制剂分析中还有许多应用的相關注意事項。

首先，对于蛋白质等大分子的分离，需要选择适当的柱填料和柱寸，以充分保证分离效果。

其次，色谱条件应不断优化，包括溶剂体系的调整、温度的控制等，以获得更好的分离效果和分离速度。

此外，对于分离过程中的保护条件也需要特别注意，以避免样品的降解和损失。

高效液相色谱法

液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相

（四）亲和色谱固定相

亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。

高效液相色谱法(HPLC)简介

高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次差别：是检测手段和输液设备。
经典液相色谱固定相：粒度：60~600μｍ（多孔）柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境（2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项鉴别：519项杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为反映各国药典先进性的重要指标之一。