核桃蛋白酶解物的制备及抗氧化活性

核桃蛋白酶解物的制备及抗氧化活性

陈宁;孙一;刘淑莹

【摘要】采用碱性蛋白酶对核桃蛋白进行酶解,检测了所得酶解物的抗氧化能力,包括对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和羟基自由基(·OH)的清除能力；利用Sephadex G-25凝胶层析柱和反相柱对核桃蛋白酶解物进行分离纯化；采用液相色谱-质谱(LC-ESI-Q-TOF)联用方法测得抗氧化能力最强的多肽的序列为Ala-Gly-Gly-Ala,其还原力和还原型谷胱甘肽相当.%Many studies have reported that peptides from various food sources possess antioxidant activity. In the present study, walnut proteins were hydrolyzed using Alcalase 2. 4 L to obtain antioxidant peptides. The antioxidant activities of the hydrolysates were measured using 1, l-diphenyl-2-picryl hydrazyl ( DPPH) assay and hydroxyl radical scavenging activity( HRSA) assay. Then, walnut protein hydrolysates were purified sequentially by gel filtration and RP-HPLC. The sequence of the peptide with the highest antioxidative activity was identified to be Ala-Gly-Gly-Ala using RP-HPLC-ESI-MS, which was identified for the first time from walnut protein hydrolysates. The reducing power of the peptide was similar to that of L-glutathione reduced ( GSH). These results suggest that the peptide isolated from walnut protein hydrolysates is potent antioxidant and may be effectively used as food additives and as pharmaceutical agents.

【期刊名称】《高等学校化学学报》

【年(卷),期】2013(034)001

【总页数】5页(P72-76)

【关键词】核桃蛋白水解;抗氧化;纯化;抗氧化肽

【作者】陈宁;孙一;刘淑莹

【作者单位】中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心,长春130022;中国科学院研究生院,北京100039;吉林省人参科学研究院,长春130117;中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心,长春130022;吉林省人参科学研究院,长春130117【正文语种】中文

【中图分类】O657

核桃(Juglans regia L)又名胡桃，系胡桃科胡桃属植物，味甘，性温．核桃营养价值很高，日常生活中除少量新鲜食用和加工成休闲食品外，大部分用于榨油，榨油剩余的残粕中含有大量的蛋白质，但残粕的利用度却很低．核桃蛋白中含有18种氨基酸，其中有8种必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸的含量很高［1～3］．蛋白质是人体所需的重要营养素之一，在人体内以氨基酸或肽的形式被消化吸收［4］．因此，充分利用好核桃蛋白，可提高核桃产品的附加值和竞争力．

在生物体内，生物大分子的氧化是一个由自由基介导的必要的生理过程．但是过量的自由基则会给细胞带来伤害甚至死亡，导致癌症、中风、糖尿病及心肌梗塞等疾病的发生［5～11］．已有研究［12］表明，食物来源的生物活性肽具有在体内清除自由基的能力，并且比合成的抗氧化剂更安全．目前，对食物蛋白质来源的酶水解物的抗氧化性研究主要集中在大豆蛋白、小麦蛋白、鹿茸和鱼等［13～16］，而对核桃蛋白水解物抗氧化性的研究报道则较少．本文以碱性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)水解核桃蛋白，对获得的水解产物进行了葡聚糖凝胶柱和反相层析分离纯化，测

定了水解物对DPPH和羟自由基的清除能力，探讨了核桃蛋白水解物的抗氧化活性;对抗氧化能力强的多肽采用LC-ESI-Q-TOF鉴定了其一级序列．

1 实验部分

1．1 材料、试剂与仪器

核桃购自长春沃尔玛超市;碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L购自丹麦Novozymes公司;HPLC级乙腈购自美国Fisher公司;1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)，L-glutathione reduced(GSH)购自 Sigma公司．

Waters Alliance 2695高效液相色谱系统;Waters 2996二极管阵列检测器;RRLC-Q-TOF 6520质谱仪(Agilent公司);ZORBAX Extend-C18色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×150 mm，Agilent公司);多功能酶标仪(Tecan公司)．

1．2 核桃蛋白酶解物的制备与分离纯化

1．2．1 核桃蛋白的制备将核桃去皮粉碎过40目筛，用石油醚脱脂2次(料液体

积比1∶10);用NaOH调节pH=9.0，于45℃孵育1 h，以3500 r/min转速离心30 min，取上清液调节pH=4.5后静置，以3500 r/min转速离心30 min，将沉淀用水洗至中性，冻干即得核桃蛋白．

1．2．2 核桃蛋白酶解物的制备取一定量的核桃蛋白用水溶解(质量分数3%)，用0.5 mol/L NaOH调节反应体系pH=8.0，于50℃恒温振荡反应．将50℃预热的碱性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)加入到反应体系中，启动酶解反应;反应过程中加入NaOH以维持反应体系的pH值．反应3 h后，于90℃水浴保持10 min，使酶

失活;以3500 r/min转速离心30 min，上清液即为核桃蛋白酶解物．

1．2．3 核桃蛋白酶解物的分离纯化将核桃蛋白酶解物用截留分子量(MWCO)为3000的超滤管进行超滤，超滤组分进行抗氧化实验．

对核桃蛋白酶解物超滤后抗氧化强的组分进一步用Sephadex G-25凝胶层析柱分离纯化，收集各组分、冻干，进行抗氧化实验筛选．