大环内酯类抗生素生物合成途径基因工程的研究

10 医药前沿

2013年2月

2.3 正交试验结果 按上述L9(34)表对其进行正交试验，试验结果以及方差分析分别见表3和表4。直观分析和方差分析表明，影响包合物包合率大小的因素依次为D>B>C>A。B、D 因素的P<0.01为重要影响因素；C 因素P<0.05为主要因素，A 因素无明显影响。所以根据工艺实际情况，预测最佳制备工艺为A2B2C3D2。即每毫升挥发油用5克β-环糊精，9克纯化水，60℃搅拌2.0

小时。

2.4 最佳包合工艺验证试验 按正交试验所筛选的最佳包合工艺A2B2C3D2，即每毫升挥发油用5克β-环糊精，9克纯化水，60℃搅拌2.0小时。重复做三批止泻挥发油β-环糊精包合试验，结果见表5。

由表5可见，平均三批包合物收率为83.4%，RSD 为1.12%，说

明该工艺稳定可靠。

2.5 包合物稳定性考察 本次研究主要目的是抗氧化、挥发、保持产品稳定性不变，排除苦涩味和辛辣味。为验证止泻挥发油经β-环糊精包合后，其稳定性有显著增强，分别称取适量的包合物和β-环糊精与油的混合物(投料比与包合物制备方法相同)各3份，放于蒸发皿中，在60℃恒温箱中放置，于第0、1、3天取样，测定挥发油的含量，并计算保留率。以第0天的挥发油含量值为100%，比较其对热稳定性。结果见表6。

3 结论

本试验通过对饱和水溶液法、超声法和研磨法三种包合方法的比较，以饱和水溶液法的挥发油包合率较高，相对于其他两种方法，比较适合制剂生产中规模生产。通过正交试验，对止泻挥发油β-环糊精包合物制备工艺进行了研究，确定了最佳制备工艺。并按照最佳制备工艺重复三次验证试验，挥发油的包合率达到了83.4%，RSD 为1.01%，说明该工艺稳定可行。 参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂第六册[S].33

[2]周利国，魏凤玲.环糊精包合技术及应用[J].医学创新研究，2006,3(3)：31-33.

[3]李慧，边宝林，孟繁蕴，等.正交试验法优选川芎、当归挥发油的β-环糊精包合工艺[J].

广州中医药大学学报，2005,22(6):471-472.

[4]张幸生.薄荷油β-环糊精包合物的制备工艺研究.时珍国医国药[J]，2005,3(12):55.

大环内酯类抗生素生物合成途径基因工程的研究

牟尧 (上海师范大学 200234)

【摘要】大环内酯类抗生素作为临床治疗感染疾病的首选药物，加强其基因工程中基因结构和生物合成的深入研究和应用基因工程技术对大环内酯类抗生素的结构进行合理改造，对增强其药物价值具有重要的意义。本文主要从大环内酯类抗生素的生物合成、酮内酯类抗生素的结构基因工程修饰、必特螺旋霉素的生物合成、麦迪霉素的基因重组等热点问题进行了综述。

【关键词】大环内酯 PKS 组合生物合成 聚酮

【中图分类号】R915 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）06-0010-02

大环内酯类抗生素是一种具有大内酯环基本化学结构的抗生素，多为碱性亲脂性化合物。该类化合物通过与核糖核蛋白体的50S 亚单位结合，可对肽酰基转移酶起到抑制作用，从而阻止肽链增长，妨碍核糖核蛋白移位，对细菌蛋白质的合成起到抑制的作用，在临床治疗感染疾病中发挥着重要的药用价值。近年来，随着医学技术和生物工程技术的不断发展，大环内酯类抗生素的基因工程研究进展不断加快，一方面，人们已从基因结构和生物合成全方位、更深入的进行了大环内酯类抗生素的基因工程的研究，另一方面，在上述研究的基础上，人们还有目的、有计划的应用基因工程技术对大环内酯类抗生素的结构进行改造，创造出了一些体内外抗菌活性高、临床治疗效果显著的新型大环内酯类抗生素。

1.大环内酯类抗生素的生物合成

大环内酯类抗生素多为碱性亲脂性化合物，而这类碱性亲脂性化合物的属性又为聚酮类化合物。在聚酮类化合物生成过程中有一必不可少的机制，即多酶体系——聚酮合酶(PKS)催化作用。组成PKS 的多肽上均携带有酶，而这些酶正是参与聚酮生物合成所必须的。每个结构域的酶只参与整个聚酮碳链中的一步反应。那么聚酮类化合物合成途径中关键酶的整个基因簇功能是如何实现的呢？

PKS 多酶体系由一个起始组件和多个延伸组件共同构成，其功能和结构都比较复杂。主要是因为每一个延伸组件都能将一个特异的乙酰辅酶A 前体添加到聚酮链上，且还能特异改变β-酮基。因此，聚酮链结构的组成主要由PKS 中延伸组件的组成次序来决定[1]。

目前PKS 分为PKSI，PKSII 和PKSHI。在基因工程研究上，研究者认为对PKS 的组成单元进行基因操作可产生新的化合物。寿佳丽，裘娟萍[2]在多杀菌素的研究领域中，为研究出杀虫谱覆盖范围更广的药剂，通过基因工程技术的应用，改造了多杀菌素的生物合成和化学修饰，生成了一种多杀菌素结构类似物——丁烯基多杀菌素。他们在研究中使用基因阻断法对丁烯基多杀菌素合成相关的基因（bus）的功能进行确定，发现丁烯基多杀菌素的生物合成主要是由PKS 5个头尾相连的基因构成的基因簇，这些基因簇来负责在C21上合成丁烯基替代多杀菌素相应位置上的乙基，进而实现合成大环内酯结构。同时，在该基因簇A I 和A Ⅱ间之间，不含有非PKS 功能的插入因子，因此，该化合物的生物合作打破了传统红霉素PKS 基因工程的保守序列，比多杀菌素具有更多的衍生物，进而扩大药用范围。

2.酮内酯类抗生素的结构基因工程修饰

随着细菌感染疾病临床治疗中大环内酯类抗生素的广泛应用，疾病的抗药性也越来越强。因此，研究具备更好药物动力学性质的大环内酯类抗生素药物成为广大药学研究工作者探讨的重要课题。酮内酯类抗生素是通过基因工程结构修饰技术用羰基取代了大环内酯3位上的克拉定糖，合成的14元环大环内酯类抗生素的衍生物。李赞，徐进宜，顾觉奋在其研究中表明：酮内酯类抗生素生物合成路径的主要依据是大环内酯3位上的克拉定糖显示出诱导细菌耐药的特性，因此，为将该特性除去，采用水解的方法用羰基取代了大环内酯3位上的克拉定糖，进而生成酮内酯类抗生素化合物。且生成的酮内酯有2个作用靶点：A752和A2058。当细菌发挥强烈的抗药性时，酮内酯的这2个作用靶点联合作用可发挥强大的抗菌活性，具有更好药物动力学性质。