无菌检查法

无菌检查法
1.目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。

2.范围：对成品的无菌检查。

3.责任：质量监督部。

4.内容：
4.1概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种
方法。

无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。

4.2仪器、设备和用具：
℃及除湿装置。

缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。

℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。

无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控
制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。

℃的生化培养箱。

4.2.3离心机、显微镜、高压消毒炉、标准pH比色器（0.02
酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。

℃灭菌30分钟。

4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉
花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。

±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。

适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。

4.3试液：
4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。

4.3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。

4.3.3灭菌生理盐水0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角
瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。

4.3.4新洁尔尔灭（1:1000）溶液。

4.3.53-5％甲酚溶液。

4.3.60.02％酚红指示剂pH6.8-8.4系列比色液管。

4.3.7溴钾酚蓝指示剂pH6.0-7.6系列比色液管。

4.3.82mol／L盐酸溶液。

4.3.92mol／L氢氧化钠溶液。

4.4培养基：
4.4.2.1除葡萄糖和指示剂外，将处方中各成分加水后置有
石棉网的电炉或适宜的加热设备中，使微温溶解。

用2mol/L盐酸溶液或2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值，使其比规定的pH值略高0.4-0.6，煮沸，用棉（纸）浆减压抽滤或以脱脂棉、滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。

4.4.2.2加入葡萄糖和指示剂溶液，摇匀，补足水量，调节
pH值（比规定的pH值略高0.2-0.4），使灭菌后为7.1±0.2，分装，装量不宜超过容器的2／3，以免灭菌时溢出。

4.4.3培养基灵敏度检查：新购的干燥培养基或采用不同牌
号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。

A需气菌、厌气菌培养基，用藤黄微球菌和生孢梭菌两种菌检查。

取藤黄微球菌[MicrococcuIuteaCMCC（B）28001］的新鲜斜面培养物，加灭菌生理盐水约3ml，制成均匀的菌悬
液，然后以10倍系列稀释后并计数，将该菌稀释成
1:105-1:108的系列浓度管。

取生孢梭菌[ClostridiumsporogonesCMCC（B）64941]的需气、厌气培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸
至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用灭
菌生理盐水制成均匀菌悬液，照上述方法进行稀释并
计数，将该菌稀释成1:106一1:109系列浓度管。

B霉菌培养基用白色念珠菌检查
取白色念珠菌[CandidaalbicansCMCC（F）98001］霉菌琼脂培养基斜面的新鲜培养物，接种至霉菌培养基内，
20-25℃培养24小时。

照藤黄微球菌项下方法稀释及
计数。

将该菌稀释成1:105-1:108系列浓度管。

C将上述制备的各菌的系列浓度管各1ml，分别接种于9ml 试验培养基中，每个稀释浓度至少接种3管，以未接
种的培养基管对照，细菌试验管置30-35℃培养3天，
白色念珠菌试验管置20-25℃培养5天，逐日记录结
果。

D结果判断以接种后培养基管数的2／3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种量均应小于10个
菌落），3次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判断
标准。

需气菌、厌气菌培养基灵敏度藤黄微球菌1:106,生孢梭菌
1:107，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:106。

4.4.4配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周，
临用前细菌和霉菌培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。

4.5对照用菌液的制备：
“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。

aureusCMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35℃培养16-18小时，用灭菌生理盐水稀释成1:106
sporogonesCMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时，用灭菌生理盐水稀释成1:106。

CMCC（F）98001]的霉菌琼脂培养基斜面培养物少许，接种至霉菌培养基内，在20-25℃培养24小时，用灭菌生理盐水稀释成1:105。

4.6检查法的操作：
4.6.1供试品、培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用
0.1％新洁尔灭或酒精棉擦拭瓶（管）外壁，然后连同其
它用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，打开无菌间紫外光灯和空气过滤装置开关并使其工作在1小时以上。

粉针剂、油剂等橡皮塞铝盖压封小瓶先用75％酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒镊子剔去铝盖上的铝质小圆片。

用碘酒棉球拭抹瓶盖及橡皮塞，再用75％酒精棉球擦去碘酒，并将酒精棉球盖于橡皮塞上待取样。

供试品溶液的每管接种量与培养基分装量
供试品装量（ml）每管接种量（ml）培养基分装
量（ml）
2ml或2ml以下0.510
接种后轻轻摇动，使匀，需气菌、厌氧菌培养基在30-35℃培养5日，霉菌培养基在20-25℃培养7日，培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长），并填写无菌检查记录表。

如在加入供试品溶液后培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取该培养液种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48-72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在接种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。

4.7结果判断：当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时，可
根据观察所得的结果判定，如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任
何管显混浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法复试2次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。