体外细菌实验方案

评价药物的抗幽门螺旋杆菌活性等指标

⑴检测药物对幽门螺旋杆菌标准菌株的最小抑菌浓度。

⑵检测药物对幽门螺旋杆菌标准菌株的最小杀菌浓度。

⑶检测药物对临床各种幽门螺旋杆菌耐药菌株的最小抑菌浓度。

⑷评价药物对临床一线治疗幽门螺旋杆菌药物甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素

等是否具有协同作用。

⑸评价幽门螺旋杆菌标准菌株对药物是否耐药及耐药频率是多少？该药物与

临床治疗幽门螺旋杆菌一线药物是否存在交叉耐药。

⑹评估药物的毒性。

⑺看是否可以构建幽门螺旋杆菌的持留菌模型，以检测药物对处于持留状态

的幽门螺旋杆菌是否具有杀灭作用。

⑻评价在酸性条件下，药物对幽门螺旋杆菌是否也具有抑制作用。

实验方法

药物对幽门螺旋杆菌标准菌株及临床各种耐药菌株最小抑菌浓度（Minimum 甲硝唑ibitory concentration, MIC）的测定药物对幽门螺旋杆菌最小抑菌浓度MIC是评价药物活性一个非常重要的指标。具体方法如下：

1培养细菌到达对数期，此时OD600应该在0.6-0.8之间。

2取菌液2ml至2个1.5ml的EP管内。

38,000rpm离心10min，去除上清，用新鲜配制的培养基洗涤一次。

4调节菌浓度至OD600=0.1，此浓度与0.5McFarland相当，约1×107 cfu/mL（所用培养基为1×）。另一个EP里调节菌浓度至OD600=0.2，相当于2×107 cfu/mL （所用培养基为2×）

5用相应浓度培养基稀释菌液100倍至浓度为1×105 cfu/mL和2×105 cfu/mL。6溶解药物。

7取灭菌96孔圆底微孔板，在板四周每孔加200μl灭菌去离子水，目的是减少检测孔内的培养基蒸发。

8在第二列孔B至G内，加100μl已经调节为2×105 cfu/mL浓度的待检测菌液（所用培养基为2×）。其余孔内B3至G11加入100μl已经调节为1×105 cfu/mL浓度的待检测菌液菌液（所用培养基为1×）。

9在第二列孔内分别加入100μl药物药物。充分混匀后，取100μl菌液加入到下一个孔内，依次类推。加到G10时取出100μl弃掉。G11不加药物做为对照。

10盖好96孔板，温箱培养，无肉眼可见菌生长所需药物最低浓度为MIC。

11实验重复测定3次，每次3个重复，确保实验的准确性。

12同时也要检测临床一线药物甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素对幽门螺旋杆菌的MIC。

检测药物对幽门螺旋杆菌标准菌株的最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration,MBC）

具体方法如下：

1. 测定药物对幽门螺旋杆菌菌株的MIC。

2. 从没有肉眼可见菌生长的孔内取100μl涂平板，至温箱培养。

3. cfu计数，cfu减少99.9%所需的药物最小浓度即为MBC。

药物与临床一线治疗幽门螺旋杆菌药物甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素协同作用实验

目前治疗幽门螺旋杆菌都是联合用药，本实验来评价药物与临床一线治疗幽门螺旋杆菌药物甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素是否具有协同作用，为联合用药做为理论依据，具体方法如下：

1.先分别测定甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素对幽门螺旋杆菌的MIC。

2调节菌浓度OD600=0.2，再稀释100倍至菌浓度为2×105 cfu/mL（所用培养基为2×）。

3分别配置甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素，使之浓度为加1μl化合物在200μl 体系菌液里的浓度分别为该药物对幽门螺旋杆菌菌株MIC的1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/8、1/10MIC 7个不同的浓度。

4取无菌的96孔板，在检测孔内均加入100μl的浓度为2×105cfu/mL的幽门螺旋杆菌菌液（所用培养基为2×）。

5然后在孔内分别加入不同浓度的化合物：一线药物以横向浓度逐渐减少的方式加入1μl，我们所提取的药物以纵向浓度逐渐减少的方式加入100μl，形成一种网格交叉的方式，其中留有一列的菌液不加任何药物做为对照（见表）。6每个协同作用实验重复3次。加好样品后，温箱内孵育观察结果。

7从每种化合物单独的MIC值和联合的MIC值可以计算出fractional inhibitory concentration (FIC)和FIC index (FICI)。FIC是联合用药中每种化合物的MIC 值，FICI等于联合用药中每种化合物MIC值的总和。FICI≤0.5为具有正协同作用，FICI>4.0认为具有拮抗作用，FICI值介于0.5与4之间认为没有协同

作用，为相加作用。

表药物与一线药物甲硝唑等协同作用

幽门螺旋杆菌对药物耐药菌株的筛选和耐药频率的测定本实验就幽门螺旋杆菌对药物是否会产生耐药性，及耐药频率等指标进行了评价。

1.培养幽门螺旋杆菌至对数期。

2.调节菌浓度为2×108-9 cells/ml。

3.配固体平板，固体培养基内含有不同浓度的药物。药物浓度的选择基于先前

测定的MIC值。可先设置药物浓度为2MIC。

4.同时以甲硝唑，阿莫西林，克拉霉素做为对照，，平板所含药物浓度也分别为

2MIC。

5.取调节好浓度的菌液100μl涂含有相应浓度化合物的固体平板。同时稀释菌溶

液，取适量涂于不含任何化合物的固体平板。至温箱培养。

6.cfu计数涂于含有药物固体平板上长出的菌落数，以涂于不含药物平板的菌落

数做为比较，计算出耐药频率。

7.配制液体培养液，准备若干个灭菌小瓶子，每个小瓶子无菌分装5ml左右培养

液。

8.分别挑耐药菌落至小瓶子内培养。

9.待耐药菌生长至对数期时，检测药物对该耐药菌株的MIC，观察MIC是否发

生变化，确定是否耐药。同时保种筛选出的耐药菌株。

10.把耐药菌株传代培养，传数代后再次检测药物对该菌株的MIC，观察该耐药

菌株的遗传稳定性如何。

11.综合评价幽门螺旋杆菌对药物的耐药性，并与甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素

等做比较。

Determination of serum inhibitory titre (SIT) of drug

Eight-week-old Swiss mice (NCI) were administered drug(75,150,300 mg kg-1), and no drug in 0.2 ml sterile water by oral gavage. Mice were then anaesthetized and exsanguinated 0.5、1 and 2 h after dosing respectively. Serum was prepared and samples from each group were pooled. Serial twofold dilutions of serum were made in broth inoculated with HP bacilli. These cultures were then incubated at 37 ℃and inspected for growth 3 days later to assess the serum concentration of drugs that inhibited bacterial growth.

该实验可以判定药物吸收后在血液中的药物浓度是否能够抑制幽门螺旋杆菌的生长，也能间接判断药代。

Toxicity experiments.

For in vitro testing of the toxicity of the drug, mice will be used. To further evaluate the toxicity of drug, doses of 100mg/kg and 300mg/kg will be given to mice by gavage, up to 14 days and compared with vehicle alone. We will observe apparent discomfort symptoms and weight loss. We will have 10 mice per group for the above groups in the toxicity experiment.