转座子引起的插入突变

实验六转座子引起的插入突变

一、实验目的

通过实验进一步认识转座子的遗传学效应之一：转座可引起插入突变。

二、实验原理

转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。

复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS 序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。

转座作用的遗传学效应有如下几个方面，转座引起插入突变；转座产生新的基因；转座产生染色体畸变；转座引起的生物进化。

常见的大肠杆菌复合转座子的抗药性、大小、末端重复序列和转座特性

转座子抗药性大小（bp）末端重复序列转座特异性转移频率

Tn1 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn2 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn3 Ap 4600 140bp（反向）低一般

低低

Tn4 Su、Sm 20500 140bp

（并带有Tn3）

Tn5 Kan 5200 1460bp 低

Tn6 Kan 4100 低

Tn7 Tp、Kan 高低

Tn9 Cm 2500 800bp（顺向）

（实际上即IS1）

Tn10 Tc 9300 1400bp（反向）

一般

（实际上即IS2）

Ap：氨苄青霉素抗性

Su：磺胺抗性

Kan：卡那霉素抗性

Sm：链霉素抗性

Cm：氯霉素抗性

Tc：四环素抗性

Tp：甲氨苄氨嘧啶抗性

大肠杆菌复合转座子的插入突变有两个表型效应：基因突变和由转座子带来的抗药性。例如将Tn5插入到F’lac+ pro+/Str s的乳糖发酵基因中去以引起lac突变，可先将这F’因子转移到Δ(lac pro)Str r受体细胞中去，再观察是否发生了插入突变。在能排除供体的含链霉素的培养基上选择pro+受体菌落，若是抗卡那霉素的，那就是说受体细菌不但接受了F’因子，而且这F’因子带有Tn5，如果它又由lac 变为lac-，不能在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长，那么，这一插入位置就是在乳糖发酵基因中。

为进一步提高效率，还可以采取一种措施，使在特定条件下lac+细菌不能生存而lac-细菌能够生存。已经知道gal E突变型在有乳糖和半乳糖存在的情况下，由于细胞中积累有毒的半乳糖代谢中间产物UDP-gal和gal-1-P而死亡，所以如果采用gal E突变型作为受体细菌，在含有0.02%乳糖和0.2%甘油的基本培养基上，受体细菌如果接受了一个F’lac+pro+，就不能生存。如果lac 基因由于插入了Tn5而成为lac-，那么受体细菌便能生存下来。

三、实验材料

1、菌株

受体菌：FD1006-Δ(lac proB) gal E str r

供体菌：Tn5·Gmlβλ-F’lac+pro+/Δ(proB lac)Val-

2、培养基

a、LB培养液

b、生理盐水

c、A培养基：含链霉素、葡萄糖的基本培养基

d、B培养基：含链霉素、卡那霉素、乳糖、甘油的基本培养基

2 4

KH2PO445g

(NH4)2SO410g

柠檬酸钠·2H2O 5g

去离子水定容至1L

pH7.0

3、仪器和耗材

恒温摇床、250mL三角瓶、离心管、培养皿、超净工作台

四、实验步骤

1. 第一天傍晚，分别接一环供体菌和一环受体菌于两支5mL LB培养液中，37℃

摇床上培养过夜。

2. 第二天，取两个内含40mL LB培养液的250mL三角瓶，分别加入1mL过夜培

养的供体菌及受体菌，在37℃摇床上培养2-3h。

3. 将新鲜培养的供体菌及受体菌各取0.5mL，在1.5mL离心管中混合，37℃轻

摇培养60min。吸取100μL混合液涂B板。

4. 吸取10μL混合菌液至含990μL生理盐水的离心管中混匀，依次稀释至10-2、

10-4、10-6倍。

5. 将供体菌及受体菌分别吸取100 μL涂于B培养基上作为对照。再从10-4、10-6

倍稀释液中各吸100 μL分别涂于A培养基平板上。37℃培养2d。

6. 观察、统计并计算：

1) 接受了供体F’lac+pro+的受体菌的数目：A板上生长的菌落数(个/mL)。

2) 在B板上生长的菌落数（个/mL），即Tn5插入到lac基因上菌落数。

3) 计算Tn5转座到lac上的转座频率，在B板上生长的菌落数/在A板上生长

的菌落数。

五、作业

1、列表记录观察结果。

2、记录A、B板上菌落数，计算Tn5易位到lacZ和lacY上引起插入突变的总频

率。

3、画出Tn5从染色体转移到F’lac上所引起lac-突变的示意图。