96孔细胞培养板 - 360文档中心

培养皿规格细胞计数

/item.htm?id=131********&ad_id=&am_id=&cm_id=&pm_id=培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量96 孔培养板0.32 0.1 10524孔培养板 2 1.0 5×10512孔培养板 4.5 2.0 1066孔培养板9.6 2.5 2.5×1063.5 cm 培养皿8 3.0 2×1066 cm 培养皿21 5.0 5.2×10610 cm 培养皿55 10.0 13.7×10625cm2 培养瓶25 5.0 5×10675cm2 培养瓶75 15～30 2×107细胞计数（转载）来源：苌生科的日志实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：一、准备工作：取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。

二、细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

三、细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。

5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

细胞活力测试实验报告

通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。

实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。

3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。

4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。

5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。

6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。

7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。

8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。

9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。

1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。

2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。

实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。

本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。

实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。

病毒感染力的滴定(TCID50的测定)

实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数致死量LD50半数鸡胚感染量EID(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测50（50% tissue culture infective dose)：用细胞半数细胞培养物感染量TCID50来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。

3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法CPE：Cytopathic effect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝ 0.8=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数lgTCID50=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID=10-3.8/0.1ml50含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

MTT试验的一些细节问题

MTT试验的一些细节问题MTT试验的一些细节问题细胞：细胞：1.选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。

200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。

用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

平板细胞克隆实验报告

实验目的：本研究旨在通过平板细胞克隆实验检测细胞的增殖能力，评估不同处理条件下细胞的生长状态和克隆形成率。

实验材料：1. 细胞样品：人胚胎肾上皮细胞（HEK293）2. 培养基：DMEM（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 胰蛋白酶5. PBS缓冲液6. 多聚甲醛7. Giemsa染液8. 培养皿9. 培养箱10. 显微镜实验方法：1. 取对数生长期的HEK293细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞。

2. 将细胞悬液以每孔1000个细胞接种于96孔培养板中，每组设置3个复孔。

3. 分别在实验组和对照组中加入不同浓度的处理试剂（如药物、基因沉默等）。

4. 将培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养2-3周。

5. 观察细胞生长状态，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

6. 弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

7. 加入适量多聚甲醛固定细胞15分钟。

8. 去固定液，加入适量Giemsa染液染色10-30分钟。

9. 用流水缓慢洗去染色液，晾干。

10. 在显微镜下观察并计数克隆数。

实验结果：1. 实验组与对照组相比，克隆数量显著减少，表明处理试剂对细胞增殖具有抑制作用。

2. 不同浓度的处理试剂对细胞增殖的抑制作用存在差异，其中低浓度处理试剂对细胞增殖的影响较小，而高浓度处理试剂对细胞增殖的抑制作用明显增强。

3. 克隆形成率随处理试剂浓度的增加而降低，表明细胞增殖能力受到抑制。

实验讨论：平板细胞克隆实验是一种常用的细胞增殖检测方法，可以有效地评估细胞的生长状态和克隆形成能力。

本研究结果表明，处理试剂对HEK293细胞的增殖具有抑制作用，且抑制作用与处理试剂的浓度呈正相关。

这表明，通过平板细胞克隆实验可以初步筛选出对细胞增殖具有抑制作用的化合物或基因。

实验结论：本研究通过平板细胞克隆实验检测了HEK293细胞的增殖能力，并评估了不同处理条件下细胞的生长状态和克隆形成率。

实验结果表明，处理试剂对细胞增殖具有抑制作用，且抑制作用与处理试剂的浓度呈正相关。

细胞毒性试验总结

（一）实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。

200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。

用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

（二）实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

MTT法检测细胞相对数和相对活力

MTT法检测细胞相对数和相对活力
MTT法检测细胞相对数和相对活力
一、实验原理
MTT比色法是一种检测细胞存活率和增殖率的方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，其颜色深浅与酶活力成正比，所以测定570nm 波长的O.D值可以反映琥珀酸脱氢酶活力高低，间接反映活细胞数量多少。

二、实验目的
了解并掌握MTT法的基本原理及基本过程。

三、实验器具
96孔细胞培养板、微量加样器、吸头、吸头盒、酶联免疫检测仪、显微镜、细胞计数板等。

四、实验方法
1.细胞接种: 将处于对数生长期的细胞用培养基制成2×105细胞/ml的悬液，用微量加样器接种于96孔板中,每孔100ul, 边缘孔中不加细胞，仅加培养基作为无细胞空白。

37℃培养箱中培养，使细胞贴壁。

2.加药: 弃去培养掖，于相应实验孔中加不同浓度的药物，每孔100ul，留数孔不加药，而加入等体积培养液作空白对照，继续培养24h。

3.加MTT: 弃培养液，每孔中加入200ul D-Hanks洗一次，每孔再加入100ul MTT(1mg/ml)，37o C继续培养4小时。

4.洗板:吸去MTT，每孔中加入200ul D-Hanks洗一次,最后吸干孔内液体。

5.溶解: 每孔中加入二甲亚砜(DMSO)200ul，溶解细胞内MTT，室温下放30min, 并不时摇动。

6.测定: 在酶联免疫仪上于570nm波长处测定O.D值。

以无细胞空白孔为零点，作好记录。

单克隆培养实验报告

一、实验目的1. 掌握单克隆抗体制备的基本原理和实验技术。

2. 熟悉杂交瘤细胞培养、筛选和克隆的实验操作。

3. 提高实验技能和数据分析能力。

二、实验原理单克隆抗体是由单个B淋巴细胞产生的特异性抗体，具有高度特异性和亲和力。

本实验采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，具体步骤如下：1. 免疫动物：选择合适的抗原免疫小鼠，使其产生特异性抗体。

2. 融合：将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

3. 筛选：通过ELISA等方法筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。

4. 克隆：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，确保抗体特异性。

5. 扩增：扩大培养克隆化的杂交瘤细胞，收集抗体。

三、实验材料1. 兔抗小鼠IgG抗体2. 兔抗小鼠IgG-HRP3. 酶联免疫吸附剂（ELISA）板4. 小鼠骨髓瘤细胞系（如SP2/0）5. 免疫小鼠脾细胞6. 96孔细胞培养板7. 24孔细胞培养板8. 50ml细胞培养瓶9. RPMI-1640培养基10. 10%胎牛血清11. 0.25%胰酶-EDTA12. 1%双抗13. 0.2%聚乙二醇（PEG）14. 离心机15. 酶标仪16. 紫外线照射灯17. 生物安全柜四、实验步骤1. 免疫动物：用兔抗小鼠IgG抗体免疫小鼠，待抗体产生后，取脾细胞。

2. 融合：将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞按照1:1比例混合，加入0.2% PEG，在室温下孵育30分钟，然后加入RPMI-1640培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

3. 筛选：采用ELISA法筛选能分泌抗体的杂交瘤细胞。

首先包被ELISA板，加入兔抗小鼠IgG抗体，洗涤后加入杂交瘤细胞培养上清，再加入兔抗小鼠IgG-HRP，最后加入底物显色，读取OD值。

4. 克隆：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。

将细胞铺板于96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

5. 扩增：将克隆化的杂交瘤细胞进行扩大培养。

96孔板的介绍

不常用96孔板介绍我们在平时实验中，最多应用96孔板，无非是96孔PCR板、细胞培养板和ELISA板，这些常见的我就不一一介绍；今天和大家一起了解一些，比较不常用的96孔微孔板，了解了以后也许能应用上。

有什么问题可交流；QQ：1294004728首先介绍相关参数：96孔聚苯乙烯微孔板*U型底微孔底为圆形，适用于进行凝聚实验；无死角，适用于移取液体；直径：6.94mm,孔高：10.3mm, 板高：14.2mm总体积：323 μl ;工作体积：40-280 μl*V 型底微孔底部为V型，适用于精准取样；适用于存储微量样品。

直径：6.18mm,孔高：10.8mm, 板高：14.1mm总体积：324 μl ;工作体积：40-200 μl*平底底部是水平的，光透底部不会发生偏折，适用于精密光学实验（底部读取信号）；口直径：6.96mm,底直径：6.39mm;孔高：10.9mm, 板高：14.6mm总体积：382 μl ;工作体积：25-340 μl ;底面积：32mm2.*平底/独立柱状孔与孔之间距离大些，独立分开，能最大程度地减少交叉污染；口直径：6.96mm,底直径：6.58mm;孔高：10.9mm, 板高：14.4mm总体积：392 μl ;工作体积：25-340 μl ;底面积：34mm2.* μClear®(软）底为透明，底部厚度为190μm+20μm，自发荧光极小，在激发波长470nm----590nm之间，最大自发荧光值是10100RFU；适用于荧光显微镜技术，偏振光透过板子时只有极少部分去偏振化。

*白色板主要用于自发光分析检测，底物显色（如双荧光素酶报告基因分析）；*黑色板主要用于荧光检测分析，观察带荧光蛋白标签细胞（如绿色荧光检测分析）；*LUMITRACTM 是白色微孔板，主要用于自发光检测分析；*FLUOTRACTM 是黑色微孔板，主要用于荧光检测分析；LUMITRACTM200，FLUOTRACTM200 中结合力板，聚苯乙烯微孔板中结合力比高结合力表面更疏水，故更适用于无极性的蛋白质和多肽，在ELISA实验中具有高度一致性和可重复性。

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。

用前56℃灭活30min。

3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。

用前56℃灭活30min。

3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

TCID50的测定方法

实验病毒感染力的滴定（TCID50的测定）滴度：在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。

根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。

滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会就越小。

一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。

2、将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。

3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。

五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法（CPE：Cytopathic effect细胞病变影响）距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

MTT实验指导-大汇总

MTT大汇总实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2. 药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4. 培养时间。

200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6. 理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8. 避免血清干扰。

用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

生物被膜测定

生物被膜测定方法一：实验用品：PBS溶液，甲醇溶液，0.5%结晶紫，ddH2O，冰醋酸，96孔板，排枪实验步骤：用96孔板培养菌液200ul/板孔，培养——倒掉培养液将PBS倒到一个平板中——用排枪吸取200ulPBS溶液于96孔板中——倒掉PBS重复三次——用排枪吸取200ul甲醇于96孔板，固定15 min——拍掉甲醇晾干10min——用0.5%结晶紫每孔200ul进行染色（吸取结晶紫不要用排枪，要单独加）染色10min——再单独吸出染色液（同一个菌用同一个枪头）排枪吸取200ulddH2O于96孔板中，再倒掉——冲洗三遍拍干，恒温培养箱干燥——用排枪吸取200ul冰醋酸于96孔板中，用于溶解晶紫，10min ——倒掉冰醋酸直接用酶标仪再595波长，590波长下测定方法二：乳酸菌菌株37°C培养进行活化,48h后吸取菌悬液1ul加入含有MRS液体培养基lOOul/孔的96孔板,比例为1: 100,空白对照为未接菌的培养基。

42°C48h培养结束后用多功能酶标仪检测波长630nm处的光密度值A1,倒掉孔板内的培养棊,用蒸馏水水洗孔板3次以去除浮游菌,室温干燥2h,加入1%结晶紫lOOul/孔,静置20min后,蒸馏水水洗6-7次去除孔壁染液直至无色,孔板在室温下干燥30min,加入95%乙醇lOOul/孔,微量震荡器上震荡30min后,用酶标仪测定A630nm, A2,平行实验3次。

黏附率为B,可表示成膜能力,可计算为:成膜率(A1c,A2c为空白对照吸光度值,B<0.1为不粘附,为粘附成膜,0.1<B<1为中等强度粘附成膜,为强粘附成膜)。

方法三：将三代菌液的菌浓度调节至OD600nm＝2，之后按1:100比例稀释于ＭＲＳ培养基中,混匀，取200ul加入96孔中，每组3个平行，置于37摄氏度条件下恒温静置厌氧培养24h，96孔板四周边缘孔不作为试验孔,加入等体积的PBS，等体积的ＭＲＳ培养基为空白对照。

低蛋白吸附96孔v底板

低蛋白吸附96孔v底板
低蛋白吸附96孔V底板是一种实验室常用的细胞培养设备，适用于悬浮细胞培养实验。

其主要特点和优势如下：
1.低蛋白吸附：这种培养板具有特殊的表面处理，降低了蛋白质吸附，有助于减少细胞贴壁生长，使悬浮细胞更容易分离和培养。

2.96孔设计：96孔V底板提供大量的培养孔，方便进行高通量实验。

同时，V形底设计有利于细胞悬浮培养，提高细胞生长效果。

3.优质材料：低蛋白吸附96孔V底板通常采用优质塑料材料制成，具有良好的生物相容性和化学稳定性，对细胞无毒性。

4.易于操作：这种培养板设计简单，操作方便，可适用于各种实验需求。

5.广泛应用：低蛋白吸附96孔V底板广泛应用于生物科研领域，如细胞生物学、生物化学、分子生物学等实验研究。

 
需要注意的是，虽然低蛋白吸附96孔V底板具有很多优点，但仍然需要按照实验要求和细胞特性选择合适的培养条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。

 
目前市场上有很多品牌和型号的低蛋白吸附96孔V底板，在选购时，请根据实验需求、预算和供应商信誉等因素进行综合
考虑。

同时，请确保购买的产品符合我国相关法规和标准，仅用于科研用途，不应用于临床应用。

96孔细胞板密度计算公式

96孔细胞板密度计算公式细胞板是生物实验室中常用的一种实验工具，用于培养和繁殖细胞。

96孔细胞板是其中一种常见的细胞板，通常用于高通量筛选实验和细胞培养。

在进行细胞实验时，我们经常需要计算细胞的密度，以便进行后续实验。

本文将介绍如何使用96孔细胞板密度计算公式来准确计算细胞的密度。

首先，我们需要了解96孔细胞板的结构。

96孔细胞板是由96个小孔组成的，每个小孔可以容纳一定数量的细胞。

通常情况下，每个小孔的直径为6.4mm，深度为14.3mm。

在进行细胞培养时，我们需要将细胞悬浮液均匀地加入到每个小孔中，然后进行培养。

当细胞生长到一定密度时，我们就需要计算细胞的密度，以便进行后续实验。

为了计算96孔细胞板中细胞的密度，我们可以使用以下的计算公式：细胞密度 = (N/V) x (1/ε)。

其中，N代表96孔细胞板中细胞的总数，V代表96孔细胞板的总体积，ε代表每个细胞的平均体积。

首先，我们需要计算96孔细胞板中细胞的总数N。

通常情况下，我们可以使用显微镜来进行计数，但这种方法比较繁琐，而且容易出现误差。

因此，我们可以使用自动细胞计数仪来进行计数，这样可以大大提高计数的准确性和效率。

接下来，我们需要计算96孔细胞板的总体积V。

96孔细胞板的总体积可以通过测量每个小孔的直径和深度来计算得出。

一般情况下，96孔细胞板的总体积可以通过以下公式计算得出：V = πr^2h。

其中，r代表每个小孔的半径，h代表每个小孔的深度，π代表圆周率。

最后，我们需要计算每个细胞的平均体积ε。

细胞的平均体积可以通过显微镜观察和测量细胞的大小来进行计算。

通常情况下，我们可以随机选取一些细胞进行测量，然后取平均值作为每个细胞的平均体积。

将以上三个数值代入计算公式中，就可以得出96孔细胞板中细胞的密度。

通过这个计算公式，我们可以快速准确地计算出细胞的密度，为后续实验提供重要的数据支持。

需要注意的是，以上计算公式是基于理想情况下的计算，实际情况中可能会受到一些因素的影响，如细胞的聚集、细胞的死亡等。