第五章酶与细胞固定化技术

第五章酶与细胞的固定化技术

教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。

教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。

教学方法：讲授

教学手段：多媒体

第一节概述

一、游离酶使用中的局限性:

1.提取纯化繁琐,价格昂贵

2.难以重复使用

3.稳定性差

二、固定化酶研究

克服游离酶缺点的方法之一

50年代开始

60年代后期，固定化技术迅速发展

1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革

三、基本概念

1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）

（Immobilized Enzyme)

指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。

2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。

四、固定化酶优点

增加了酶的稳定性

能降低酶的总体费用

酶的分离和回收变得容易，并可重复使用

使反应过程的连续操作成为可能

反应产物也易于提取纯化

有利于过程设计和优化

拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）

第二节、酶的固定化方法

一、酶的固定化方法

1、酶的固定化方法（四大类方法）

1）吸附法

2）包埋法

3）交联法

4）化学共价法

其它（酶的逆胶束包囊法）

一、酶的固定化方法

2、选择方法依据：

⑴酶的性质

⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等

⑶制备方法简便易行

⒊衡量依据：

⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率；

⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）；

⑶稳定性和不稳定原因的探究；

⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。

（一）吸附法

1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。

此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。

2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。

3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用；

缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的.

4、常用吸附剂

各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。

5、举例：

将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。

（二）包埋法

1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法

（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。

2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高；

缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。

3、海藻酸盐包埋法

海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

缺点:

在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定.

Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解

优点:

海藻酸盐价格便宜

包埋条件温和

4、角叉菜糖包埋法

K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即生成凝胶.

缺点:

对高浓度的Na+离子敏感

固定化温度高,需要在37℃~55℃

5、聚丙烯酰胺凝胶

在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂N,N’-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶

缺点:

丙烯酰胺对酶具有变性作用

6、聚乙烯醇（PVA）包埋法

磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法

硼酸硬化法:

将聚乙烯醇在70℃~ 80℃进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35℃,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中

优点:

原材料价格便宜

条件温和

无毒害作用

循环冷冻法

硼酸硬化法

7、半透膜包埋法

7.1 界面沉淀法

利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋。

操作：酶液在油溶性表面活性剂存在下在水不互溶的有机相中乳化形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂帮助下由有机相移入水相。

7、半透膜包埋法

7.2界面聚合法

利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。

例:

将含10%血红蛋白的酶液与1，6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盘-85的氯仿-环己烷中分散乳化，再加入溶于有机相的葵二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。