全血胆碱酯酶活性测定
6,胆碱酯酶活性测定
实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。
2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。
3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。
（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。
2．恒温水箱(37±0.5℃)。
3．离心机。
4．分光光度计，10mm比色皿。
5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。
（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。
2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。
取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。
3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。
4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
出现黄色即弃用。
6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。
7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。
此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。
因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。
（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。
全血胆碱酯酶活性测定教案
二、仪器
• • • • • • 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。
三、试剂
• 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4· 12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3· 6H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70μmol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7μmol/mL乙酰胆碱
全血胆碱酯酶活性的分光光度 测定方法
----羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996
一、原理
• 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 • 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性 羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化 铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络 合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。 在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱 的量计算胆碱酯酶活性。
四、采样、运输和保存
• 用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色 管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立 即进行测定。 • 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入 玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。 于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保 存一周。
五、分析步骤
管号 乙酰胆碱标准 应用液(ml) 磷酸盐缓冲液 乙酰胆碱含量 (umol) 0 0 1.0 0 1 0.1 0.9 0.35 2 0.2 0.8 0.7 3 0.3 0.7 1.05 4 0.4 0.6 1.4 5 0.5 0.5 1.75 样品 A 血 0.02 ml 0.98ml 对照 B 血 0.02 ml 0.98ml
全血胆碱酯酶活性的测定之欧阳家百创编
全血胆碱酯酶活性的测定欧阳家百（2021.03.07）——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。
2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的采集。
实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min+1.0mL乙酰胆碱应用液 37℃水浴 30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min+1.0mL水 37℃水浴 30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴 30minD 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min +1.0mL水37℃水浴 30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min；2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min；3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B C D吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得： Xs==3.149μmolXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；A：以B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。
胆碱酯酶的测定
胆碱酯酶（CHE）的测定
一、原理：血清及组织中CHE使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，未被水解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活力。
二、试剂：
1、试剂一：溶液60ml×1瓶，室温保存。
2、试剂二：乙酰胆碱粉剂×1支，-20℃保存，稀释液5ml×1瓶，4℃保存。
80μmol/ml 乙酰胆碱底物贮备液的配制：将一支乙酰胆碱碱粉剂倒入5ml稀释液中即成，4℃。
8μmol/ml 乙酰胆碱应用液的配制：贮备液：试剂=1：9稀释。
3、试剂三：甲粉剂×1支；乙液30ml×1瓶；丙液30ml×1瓶；室温保存。
试剂三应用液的配制：每次测试前将甲粉倒入乙液中，充分摇匀，根据需要量将甲乙混合液与丙液等量混合，充分混匀，配成试剂三应用液，现用现配。
4、试剂四：溶液30ml×1瓶，室温保存。
5、试剂五：溶液20ml×1瓶，室温保存。
6、试剂六：粉剂×1瓶，稀释液30ml×1瓶，测试前将稀释液倒入粉剂中，充分混匀，避光
4℃冷藏。
测各管吸光度值。
四、计算：
1、定义：血清中CHE的计算：每毫升血清在37℃和底物作用20分钟，分解1μmol乙酰胆
碱为1个活力单位。
2、计算公式：
血清中CHE活力。
全血胆碱酯酶活性的测定
全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤与酶测定的临床意义。
2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的采集。
实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minD 空白管 1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL 盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B CD吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得： Xs=7538.0299.0003.0538.0⨯-+=3.149μmol Xs ：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL ·37℃·30min)；A ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处样品管的吸光度值； B ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处对照管的吸光度值；C ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处标准管的吸光度值。
胆碱酯酶活力测定的中毒标准
胆碱酯酶活力测定的中毒标准
胆碱酯酶（ChE）活力测定可以用于检测有机磷农药、神经毒剂等对胆碱酯酶的抑制作用，从而判断暴露者是否中毒。
根据WHO的建议，胆碱酯酶活力的下限可以作为暴露标准的参考。
下面是常用的胆碱酯酶活力参考值：
胆碱酯酶活力正常参考值：在25℃下，健康人血浆中胆碱酯酶活力的正常范围为3300~12,000 U/L。
有机磷农药中毒参考值：血浆中胆碱酯酶活力下降到正常值的30%以下，表示中毒程度较轻；下降到正常值的10%以下，表示中毒程度较重。
神经毒剂中毒参考值：血浆中胆碱酯酶活力下降到正常值的50%以下，表示中毒程度较轻；下降到正常值的20%以下，表示中毒程度较重。
需要注意的是，由于胆碱酯酶活力受多种因素影响，如个体差异、性别、年龄等，因此，这些参考值仅供参考，具体应根据实际情况进行判断。
同时，在实际应用中，还应结合其他检测方法和中毒症状进行综合分析。
全血胆碱酯酶活性的测定讲课讲稿
蒸馏水
盐酸溶液(1＋2)
碱性羟胺溶液
磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)
三氯化铁溶液
氯化乙酰胆碱标准液
分光光度计
10mL比色管
漏斗
恒温水浴箱，控温±0.5℃
采血针头
血色素吸管
采样、运输和保存
用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤
A样品管+0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min
C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。
②计算酶活性的相对值
Y= =197
Y—酶活性的相对值，%；
Xs—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
Xc—正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min)
吸光度0.299 0.003 0.538 0.000
结果计算
①计算酶活性的绝对值
带入得：Xs= =3.149μmol
Xs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
A：以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；
B：以试剂空白为参比的在波长520nm Nhomakorabea对照管的吸光度值；
讨论
1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19±0.398μmol；因3.149μmol在3.19±0.398μmol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。
2.各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导致胆碱酯酶活性变化有关。
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性测定方法主要有以下几种常用的方法：
1. 利用酶促反应产生的色素变化测定：
(1) 比色法：将胆碱酯酶底物乙酰胆碱与碱性溴化镉等试剂反应，生成黄色产物，利用比色计或分光光度计测定产物的吸光度，间接测定胆碱酯酶活性。
(2) 荧光法：将胆碱酯酶底物与荧光染料反应，使底物和产物之间发生荧光变化，利用荧光光谱仪测定荧光强度，间接测定胆碱酯酶活性。
2. 利用电化学方法测定：常用的是反应器中使用碳电极或银电极，利用底物和产物之间的电位差变化测定胆碱酯酶活性。
3. 利用放射性同位素标记测定：将底物或产物标记上放射性同位素，通过测定放射性同位素的放射性强度，间接测定胆碱酯酶活性。
4. 利用质谱法测定：将底物和产物分离并通过质谱仪测定其质荷比，间接测定胆碱酯酶活性。
需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的实验目的和样本类型，具体的选择应根据实验需求和设备条件来确定。
全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法羟胺三氯化铁法
全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法羟胺三氯化铁法Blood—Determinatoin of cholinesterase activity—Spectrophotometricmethod—Hydroxylamine-ferric chloride method1 主题内容与适用范围本标准规定了血中胆碱酯酶活性的分光光度测定方法——羟胺三氯化铁法。
本法最低检测浓度为2.4μmol/L。
本标准适用于正常人和接触有机磷农药人员血中胆碱酯酶活性的测定。
2 原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520 nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
3 仪器3.1分光光度计，10mm比色杯。
3.2比色管，10 mL。
3.3普通漏斗，40mm。
3.4恒温水浴箱，控温士0.5℃。
3.5采血针头。
3.6血色素吸管，有20μL刻度。
4试剂本标准所用试剂均为分析纯试剂。
4.1 实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水。
4.2 盐酸，=1.19 g/mL。
4.3 盐酸溶液(1+2)。
4.4 碱性羟胺溶液，临用前将139 g/L盐酸羟胺溶液和140 g/L氢氧化钠溶液等体积混合。
4.5 磷酸盐缓冲液(pH=7.20)，准确称取磷酸氢二钠()8.36g和磷酸二氢钾()1.36g，用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内。
4.6 三氯化铁溶液，称取10 g三氯化铁()，加0.84 mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。
贮存于棕色瓶中。
4.7 氯化乙酰胆碱标准液，精确称取乙酰胆碱1.2716g，用磷酸盐缓冲液(4.5)溶解，并稀释到100 mL，此溶液1mL相当于70μmol乙酰胆碱，为贮备液。
临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液(4.5)稀释10倍，此溶液1 mL相当于7μmol乙酰胆碱，为应用液。
全血胆碱酯酶活性测定
实验五全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱脂酶活性分光光度测定方法WS/T67—1996[原理]胆碱脂酶水解硫代乙酰胆碱（ASCH，acetyl-thilcholine）,生成硫代乙酰胆碱和乙酸。
硫代胆碱与硫基现色几剂，5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸[DTNB，dithio-bis-(nitribenzoic acid)]反应，形成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB）。
在412nm长下比色定量。
[仪器]分光光度计，5mm比色杯；恒温水浴；离心机；血红蛋白吸管，20ul；刻度吸管，5.0ml, 2.0 ml；试管10ml；容量瓶，10ml。
[试剂]1．1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PH 7.4）；生理盐水：氯化钠0.85/100ml；硫代乙酰胆碱（ASCh）溶液：称取ASCh 72.3mg，溶于生理盐水中并稀释成10ml。
置冰箱中保存。
临用时，以生理盐水稀释10倍；5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）溶液：称取DTMB19.8mg，滴加硫酸缓冲液并搅拌至完全溶解，溶液透明（约2ml）。
再用生理盐水稀释至10ml ，置冰箱中保存。
临用时，用生理盐水稀释10倍；出现黄色即弃取；毒扁豆碱溶液（抑制剂）：取毒扁豆碱约1mg，溶于1ml生理盐水中。
临用时配制。
严防污染其他试剂和器材。
2．巯基标准溶液：准确称取还原型谷胱甘肽3.07mg，用水（经煮沸并冷却的水）溶解并移入10ml容量瓶中，稀释至刻度。
此溶液1ml相当于1μmol谷胱甘肽。
因谷胱甘肽易氧化，故溶液应临用时配制。
[采样、运输和保存]取10ul末梢血滴入置有肝素钠或3ml磷酸缓冲液的小试管中，混匀，加塞。
置冰瓶中运送，于4℃冰箱内保存，尽快分析。
[分析步骤]1．标准曲线的绘制：取5支试管，按实习10—6配制标准。
以水为参比测定吸光度。
从各标准管的吸光度减去0管，以酶活性为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定实习表10—6 标准管的配制管号0 1 2 3 4巯基标准溶液，ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4水，ml 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1缓冲溶液，ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DTNB溶液，ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5胆碱酯酶活性，μmol/ml 0.0 20 40 60 801．将样品从冰箱中取出，使恢复到室温，混匀待用。
三氯化铁分光光度法测定全血胆碱酯酶活性王小鹏
三氯化铁分光光度法测定全血胆碱酯酶原理：在血液胆碱酯酶作用下，乙酰胆碱发生水解；剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应生成乙酰羟胺，后者在酸性条件下，与三氯化铁反应生成红棕色羟肟酸铁配合物，呈色强度与剩余乙酰胆碱的量成正比，在５２０ｎｍ波长处比色，间接测定血中胆碱酯酶活性。
此法最低检测浓度２.４μmol/L（20μl血样），测定范围2.4~1000.0μmol/L。
步骤：1、标准的配制：取6支比色管，分别加入0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，7μmol/ml的氯化乙酰胆碱标准溶液，加标准缓冲液（PBS）至1.0ml，各加1.0ml水，配制成乙酰胆碱含量为：0.0、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0μmol标准溶液系列。
向各管中加入4.0ml 碱性羟胺，振摇2min。
加2.0ml盐酸溶液，振摇2min。
加2.0ml三氯化铁溶液，振摇。
溶液与520nm处，以第一管为参比，测定吸光度值。
以乙酰胆碱含量（μmol）对相应的吸光度值绘制标准曲线。
2、样品的处理：取4支比色管，分别为1（A,B）和2（A,B），向各管加入0.98mlPBS，20μl血样。
置于37℃水浴中预热5min。
向1和2的A管加入1.0ml乙酰胆碱标准溶液。
自加入乙酰胆碱开始计时，在37℃左右（正负0.5℃）准确反应30min，每间隔10min振摇1次，同时，向1和2的B管加入1.0ml乙酰胆碱标准溶液，充分振摇。
取出比色管，各管立即加入4.0ml碱性羟胺溶液，充分振摇2min。
然后，A和B管各加2.0ml盐酸溶液，振摇2min。
加2.0ml三氯化铁溶液，振摇后样品离心。
滤液与520nm处，以标准第一管为参比，测定吸光度。
分别用各管吸光度值计算其中乙酰胆碱剩余量，从而得出1,2号管胆碱酯酶活性。
实验数据及结果：标准曲线吸光度值如下表表1标准曲线吸光度值0 1.4 2.8 4.2 5.6 7.0胆碱酯酶溶液体积吸光度值0.004 0.139 0.260 0.395 0.475 0.600可得标准曲线为：y=0.081x+0.028 拟合方程为R2=0.994样品吸光度如下表表2样品吸光度1号2号A管0.576 0.555B管0.643 0.6561A中含有乙酰胆碱的量是6.7654 1B中含有7.5926 消耗乙酰胆碱为0.8272μmol2A中含有乙酰胆碱的量为6.5061 2B中含有7.7531 消耗乙酰胆碱量为1.247μmol由此数据可知2号管中乙酰胆碱消耗量大，估1号内乙酰胆碱酶活性被抑制为注射有有机磷农药的小鼠血样。
全血胆碱脂酶测定
注意事项
采血前先准备好试管，加入磷缓； 采血时严格消毒，用过的棉球、刺针集 中放置； 准确控制水浴温度和放置时间； 加三氯化铁显色后，在20min内比色； 参比管的溶液留用到最后。
实验报告要求
[实验目的] [实验原理] [实验步骤] [实验结果] [分析与讨论]
三氯化铁比色法
[原理]
乙酰胆碱
胆碱酯酶
胆碱 +
乙酸
碱性羟胺
乙酰羟胺
FeCl3Leabharlann HCl羟肟酸铁(棕红色络合物)
[器材] 刺针 一次性自控式微量吸管（20μl） 分光光度计 恒温水浴箱（37℃±0.5 ℃ ）
[试剂] 磷酸盐缓冲液（PH=7.20） 碱性羟胺溶液 1∶2盐酸溶液 三氯化铁溶液 氯化乙酰胆碱标准应用液（1ml含7μmol）
实验目的
加深对有机磷农药中毒机制的认识 掌握全血ChE活性测定的意义 掌握全血ChE活性测定原理、方法
意义
有机磷农药中毒的重要诊断指标 中毒者治疗后的效果观察指标 接触有机磷农药人员健康状况的动态观察指标
方法
Asch-DTNB比色法（GBZ52） 羟胺三氯化铁比色法 溴麝香草酚蓝（B·T·B）比色法 纸片法 Biocheck法（便携式分析仪）
健康人胆碱酯酶活性绝对值（0.02ml . 37 ℃ . 30min） 男：4.43 μmol 女：3.99 μmol
河南健康人胆碱酯酶活性绝对值（0.02ml . 37 ℃ . 30min） 全血：3.83±0.55μmol 血浆：0.76±0.18 μmol 红细胞: 3.07±0.45μmol
浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值 男：3.22 ±0.336 μmol 女：3.19 ±0.398 μmol
全血胆碱酯酶活性测定
六、计算
1、按式(1)计算酶活性的绝对值：被水解乙酰胆碱 吸光度=B-A。 • 以被水解乙酰胆碱吸光度查标准曲线得被水解乙 酰胆碱的量，此值为0.02ml血37℃30分钟反应条 件下胆碱酯酶活性绝对值= Xs/0.02 • 式中：Xs——水解乙酰胆碱的浓度， µmol(0.02mL·37℃·30min)； • A—以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管 的吸光度值； • B—以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管 的吸光度值。
• 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪 色，必须控制在20min内比色完毕。若大批 样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液， 否则会有较大误差。 • 滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸 光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。 • 氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需 做标准管。标准管读数在同一比色计上应 保持恒定或仅有较小的变动。 • 计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区 正常人全血胆碱酯酶活性为基准。
• 按式(2)计算酶活性的相对值：Y= Xs/ Xc • 式中：Y—酶活性的相对值，%； • Xs—被测血样中酶活性的绝对值， µmol(0.02mL·37℃·30min)； • Xc—正常人血中酶活性绝对值， µmol(0.02mL·37℃·30min)。 Xc=1.60µmol(0.02mL·37℃·30min)
二、仪器
• • • • • • 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。
三ห้องสมุดไป่ตู้试剂
• 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3·6H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70µmol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7µmol/mL乙酰胆碱
全血胆碱脂酶测定精讲
实验器材
一次性注射器(1ml) 12个，采血用； 微量移液器（20μl）；分光光度计； 玻璃比色杯(每组至少3个)；擦镜纸； 恒温水浴箱（37℃±0.5 ℃ ） 移液管(0.2ml，1ml，5ml)； 试管；漏斗；容量瓶
试剂
试剂均为分析纯，水为蒸镏水或去离子水。 1．磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2 准确称取磷 酸氢二钠(Na2HP04· 12H2O)16.72g和磷酸二氢钾 (KH2PO4)2.72g，用水溶解并稀释到1000ml， 置4℃冰箱中保存。 2．碱性羟胺溶液 临用时将139 g/L的盐酸 羟胺溶液与140 g/L的氢氧化钠溶液等体积混 合。 3．盐酸溶液1+2 浓盐酸l份加水2份混合。
A管（样品管）
37℃水浴 30min（准确计时） 碱性羟胺4ml,振3min 1∶2盐酸溶液2ml, 摇1min 10%三氯化铁溶液2ml
摇匀、过滤、比色
计算
1.被水解 的乙酰胆碱吸光度=
对照管吸光度（B管）－ 样品管吸光度（A管）
2.对照标准曲线，得出被水解的乙酰胆碱( μmol )
---即0.02ml血经37 ℃，30min反应条件下的
准确控制水浴温度和放置时间
加三氯化铁显色后，在20min内比色
参比管的溶液留用到最后
实验报告要求
[实验目的] [实验原理] [实验步骤] [实验结果]
[分析与讨论]
胆碱酯酶活性绝对值C
3.胆碱酯酶活性相对值（%）
样品胆碱酯酶活性绝对 值 100 健康人碱酯酶活性绝对 值
浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值
男：3.22 ±0.336 μmol
女：3.19 ±0.398 μmol
注意事项
采血前先准备好试管，加入磷缓 采血时严格消毒，用过的棉球、刺针集 中放置
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注意事项
• 本法检测限为2.4μmol/L，线性范围为2.4～ 1000.0μmol/L。 水冲洗干净后，再用蒸馏水洗三次， 干燥后备用。 • 取血时不应过度挤压耳垂，如果采血时过度挤 压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例 过多，会使结果偏低。 • 加碱性羟胺和盐酸(1＋2)时，必须严格掌握振 摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。
• 按式(2)计算酶活性的相对值：Y= Xs/ Xc
• 式中：Y—酶活性的相对值，%；
• Xs—被测血样中酶活性的绝对值， μmol(0.02mL·37℃· 30min)；
• Xc—正常人血中酶活性绝对值， μmol(0.02mL·37℃· 30min)。 Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃· 30min)
四、采样、运输和保存
• 用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色 管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立 即进行测定。 • 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入 玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。 于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保 存一周。
五、分析步骤
管号 乙酰胆碱标准 应用液(ml) 磷酸盐缓冲液 乙酰胆碱含量 (umol) 0 0 1.0 0 1 0.1 0.9 0.35 2 0.2 0.8 0.7 3 0.3 0.7 1.05 4 0.4 0.6 1.4 5 0.5 0.5 1.75 样品 A 血 0.02 ml 0.98ml 对照 B 血 0.02 ml 0.98ml
水浴 37℃ 5 分钟 乙酰胆碱 0.5ml 37℃30 分钟 羟胺 2 ml 羟胺 2ml 振摇 3 分钟 乙酰胆碱 0.5 ml 37℃30 分钟
碱性羟胺 1：2 HCl 100g/L FeCl3
2 ml
振摇 3 分钟 1 ml 1 ml 振摇 1 分钟
振摇 3 分钟
摇匀 离心后 520nm 比色
2、标准曲线法
• 被水解乙酰胆碱的吸光度＝C-(A-B)。
• 被水解乙酰胆碱的吸光度查乙酰胆碱标准 曲线，得相应的被水解乙酰胆碱(μmol)。此 值是0.02mL血液在37℃30min反应条件下， 胆碱酯酶的活性绝对值。
• 正常健康人全血胆碱酯酶活性可低至正常 的80% • 轻度有机磷农药中毒为正常的50% ~70% • 中度中毒为30%~50% • 重度中毒多在30%以下 • 慢性有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性在 50%以下 • 酶活性下降与症状轻重并不一致，有时酶 活性严重抑制但症状却很轻微。
二、仪器
• • • • • • 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。
三、试剂
• 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4· 12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3· 6H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70μmol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7μmol/mL乙酰胆碱
全血胆碱酯酶活性的分光光度 测定方法
----羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996
一、原理
• 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 • 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性 羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化 铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络 合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。 在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱 的量计算胆碱酯酶活性。
• 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪 色，必须控制在20min内比色完毕。若大批 样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液， 否则会有较大误差。 • 滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸 光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。 • 氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需 做标准管。标准管读数在同一比色计上应 保持恒定或仅有较小的变动。 • 计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区 正常人全血胆碱酯酶活性为基准。
六、计算
1、按式(1)计算酶活性的绝对值：被水解乙酰胆碱 吸光度=B-A。 • 以被水解乙酰胆碱吸光度查标准曲线得被水解乙 酰胆碱的量，此值为0.02ml血37℃30分钟反应条 件下胆碱酯酶活性绝对值= Xs/0.02 • 式中：Xs——水解乙酰胆碱的浓度， μmol(0.02mL·37℃· 30min)； • A—以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管 的吸光度值； • B—以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管 的吸光度值。