反硝化细菌nirS功能基因的多样性研究 论文答辩

B05站位在 各个Cluster 中都有分布
B07站位分布在 Cluster I、II、 IV、 V
60% 80% 100%
图3-15 各个站位克隆数在每个Cluster中的分布
B15站位分布在 Cluster I、 III、 IV、 V
三. 实验结果
3.8 nirS基因的系统进化分析
B01，B05，B07 站位在Cluster II中有分布 B01，B03，B05， B11，B15站位在 Cluster III中有 分布 B01，B03，B05， B07，B11，B15站 位在Cluster IV中 都有分布 B01，B03，B05， B07，B11，B15站 位在Cluster I中都 有分布
0.91 124.82
35 33
34
6.16
131.89
1.75
3.04
7.65
三. 实验结果
3.2 nirS基因文库的建立
条带长度890bp
图3-1 PCR梯度扩增电泳图
图3-2 平行PCR扩增电泳图 电泳检测条带清晰，亮度 适宜，可将平行PCR扩增 得到PCR产物加在一起做 乙醇沉淀。
图3-3 纯化电泳图 纯化条带干净没有非特异 性扩增，DNA的纯化结果 较好，可用于连接实验。
PCR产物的纯化
PMD19-T
Simple vector
2,692bp
转化
连接
二. 实验部分
基因多样性分析
筛 插入片段基因的扩增 库 及 序 限制性酶切分析 列 测 基因序列测定 定
数 据 分 析
基因文库丰度分析 多样性指数分析 聚类分析 系统进化树
三. 实验结果
3.1 环境因子
表3-1 渤海各采样站位沉积物间隙水环境因子 站位 NO2--N （μM） NH4+-N （μM） NO3--N （μM） DIN (μM) （μM）
四. 讨论
4.1基因文库方法研究反硝化细菌的优缺点
优点：
一是可以用于不可培养细菌 的多样性研究； 二是通过菌株测序获得的基 因序列可用于微生物分类学种 的研究； 三是通过上网NCBI数据库 中序列的比对可能发现新的序 列。
缺点：
在实验方案上 ，多种软件分 析也不能完全反映出反硝化细 菌生物的分布与渤海海洋生态 的关系 ； 在实验过程中，在样品采集 点更深的区域多样性有可能不 同。
二.实验部分
本实验主要分为四个部分： 环境因子的测定、 建库、筛库及数据分析
pH值 溶解氧
环 境 因 子 的 测 定
图2-1 渤海站位图
盐度
溶解性无机氮（DIN）
NH4+-N浓度 NO2--N浓度 NO3--N浓度 PO43+-P浓度
二. 实验部分
nirS基因文库的建立
宏基因组DNA的提取
基因序列的PCR扩增
V
3
2
5
1
3
分 分 析 析
本研究中的 nirS 序列在各个 Cluster 中都有分布，其中在 ClusterIV中分布 B01 站位和B05 站位在各个 Cluster 中都有分布， B01站位的分布相对均匀； 最多，有 335个有效克隆，占总克隆数的 ClusterI 次之，有 127个 B03 站位中都分布于 Cluster I、III、 IV、63.9%, V 4个Cluster 中； B07站位分布 克隆，占总克隆数的 24.2% ，在其他 3个Cluster 中ClusterII 、III 、 V中的 在 Cluster I、 II、 IV、 V 4个 Cluster中； B11站位只在 Cluster I、 III 、IV 12站位分布在 、36和14个，占总克隆数的百分数分别为 2.3%、 3分布相对较少，分别有 个Cluster中有分布；B15 Cluster I、 III、 IV、 V 4个Cluster 6.9% 中 ； 、2.7%。
PO43+-P
溶解氧 (mg/L)
pH
盐度
B01
B03 B05 B07 B11 B15
1.18
0.86
257.64
109.08
2.66
261.48
111.07
2.8
1.92
6.73
4.65
7.71
33
34 34
1.13
7.65
B01站位的数据总体较高 ；B03站位NO3-浓度和PH较 3.92 1.62 3.78 0.64 B05站位亚硝酸盐，铵盐及无机氮含量较低 36.76 41.32 低； ； 7.87 B07站位磷酸盐含量、盐度、PH值相对最高 ；B11磷7.95 1.12 57.84 2.48 61.44 5.42 4.68 酸盐和盐度较低；B15站位的溶解氧浓度和PH较低， 而硝酸盐的量相对较高 0.82 59.4 4.42 。 64.64 7.72 1.26 3.35
渤海沉积物反硝化细菌nirS功 能基因的多样性研究
姓 学 名：xxx 号：xxx
专
导
业：化学工程与技术
师：xxx 教授
主要内容简介
1 2 3
选题背景及意义 实验部分 实验结果 讨论 结论
4 5
6
致谢
一. 选题背景及意义
1.1 选题背景
渤海是中国唯一的半封闭型 内海，海水交换能力差，海洋 生态系统脆弱；
三. 实验结果
3.7 聚类分析
3.7.2 CCA分析
磷酸盐含量、硝酸盐 含量、溶解氧浓度和 PH值 溶解氧浓度，磷酸 盐含量和PH值
溶解氧浓度
硝酸盐含量和PH值 硝酸盐含量 硝酸盐含量
分 析
影响渤海反硝化细菌的主要环境因子是NO3-，其次是溶解氧浓度 图 3-11 CCA分析结果 和磷酸盐含量，影响最小的是PH 值。
四. 讨论
4.2渤海反硝化细菌群落结构与环境的关系
B01站位地处辽东湾，细菌的多样性分布受到磷酸盐含量、溶解氧浓度、 PH和硝酸盐含量的影响，可能受到辽河等多条河流注入的原因，反硝化细 菌的多样性较高；
B03站位多样性的主要影响因素是溶解氧浓度，可能是因为周围没有大 量河流的注入，污染较轻的缘故； B05站位的多样性与硝酸盐的含量相关，可能是受沿海港口以及渤海油 田等排入的污染源影响，氮污染的状况也相对严重，反硝化细菌的多样性 较高；
三. 实验结果
3.8 nirS基因的系统进化分析
图3-12 渤海nirS基因系统进化树 图3-13 nirS基因进化树 Cluster I 图3-14 nirS基因进化树 Cluster IV
三. 实验结果
3.8 nirS基因的系统进化分析
表3-4 渤海沉积物各个站位在系统进化树中的克隆数分布 Cluster I II III IV B01 26 8 3 50 26 42 B03 14 B05 16 1 4 59 50 B07 28 3 2 72 1 62 B11 20 B15 23
三. 实验结果
3.4 nirS基因多样性分析
表3-2 渤海反硝化细菌nirS的基因克隆文库分析（AA 5% cutoff） Station B01 B03 B05 B07 B11 B15 Number of clones 86 85 85 84 94 90 100%OTU 52 40 44 51 35 32 95%OTU 44 28 34 41 30 26 Unique Cover
3.59 3.06
3.28 3.55 3.10
0.86
0.78 0.82
110(70,210)
50(35,90) 94(55,208) 92(60.173) 41(31,72)
149(88,294)
74(44,155) 106(62,221) 102(66,189) 50(36,91)
52.53
20.37
I II III IV V
B15 B11 B07 B05 B03 B01
图3-16 各个Cluster包含的有效克隆数在每个站位的分布
B01，B03，B05， B07，B15站位在 Cluster V中都有分 布
三、实验结果
3.8 nirS系统进化分析
1）渤海海洋沉积物中含有nirS基因序列的大多数反硝化细菌与已知 的可培养反硝化细菌的亲缘关系较远，这就说明在渤海中的含有nirS功 能基因的反硝化细菌大部分都是不可培养的 。 2）本研究有部分序列与通过NCBI比对得到的nirS最相似序列的同源 性在70%左右，这就说明这些序列与已知的含有nirS功能基因的反硝化 细菌存在很大的不同，可能代表新的nirS序列。 3）系统进化树中渤海沉积物中的序列在长江口和东海海域、胶州湾、 海河海域、珠江、海水养殖水体、太平洋海域等都有分布，其中有些 序列的最相似序列来源于森林和湿地，表明在渤海沉积物中含有nirS功 能基因的反硝化细菌不仅在水体中有分布，在森林和湿地也有分布， 这更加说明反硝化菌株的分布具有广泛性。
渤海沿岸工农业和水产养殖 业迅猛发展，渤海海洋开发活 动加剧，再加上各个输入河流 带来的陆源营养物质，氮、磷 含量不断增加。
图1-1 渤海地图
一. 选题背景及意义
1.1 选题背景
反硝化作用由反硝化细菌还原硝酸盐或亚硝酸盐并释放N20、NO或N2 的过程，这个过程是氮素重返大气层的主要环节，对于维持整个氮循 环中氮的平衡起着举足轻重的作用 。
图1-2 反硝化功能酶和功能基因
一. 选题背景及意义
1.2 主要技术路线
沉积物样品的采集
基因文库的建立
基因文库克隆及序列测定 CCA分析 Unifrac分析、多样性指数 分析、系统进化分析 环境因子
反硝化细菌的多样性、群落分布、结构与环境因子的关系
图1-3 主要技术路线图
一. 选题背景及意义
1.3 研究目的及创新点
0.05
B01
B07
B05 B03 B11 B15
图3-9 渤海沉积物nirS基因Cluster Environment分析 B01、B05和B07站位 的关系较近，B03和 B11站位的关系介于中 间，B15站位与其它站 位关系较远 。
B01ຫໍສະໝຸດ Baidu
B07 B05 B03 B11 B15
0.05
图3-10 渤海沉积物nirS基因Jackknife Cluster分析 图3-8 渤海沉积物nirS基因PCoA分析
1）本课题采用现代分子生物学手段，以反硝化细菌基因nirS为分 子标记，对渤海的富营养化严重的生态环境进行研究，对渤海的生 态环境与反硝化细菌群落分布有一定的指示作用 。
2）通过系统进化分析及Cluster划分发现的某些序列有可能是渤海 中的新的序列，该序列的存在与渤海的生态环境息息相关。
3）本课题中通过多种统计学软件从多样性指数等多方面对渤海反 硝化群落进行分析。
33
18
61.6%
78.8% 70.6% 65.5% 79.8%
25 29
19 14
84.8%
分 经过筛库后共获得有效克隆数524个，每个站位得到的有效克隆数 析 在84-94之间。
三. 实验结果
3.5 nirS基因的基因文库丰度分析
B01站位的饱 和度最低 B15站位的饱 和度最高
B01 B03 B05 B07 B11 B15
三. 实验结果
3.8 nirS基因的系统进化分析
V IV III II I 0% 20% 40%
B03站位中都分布 于Cluster I、 III、 IV、V
B01站位在各个 Cluster中都有分 布
B01 B11站位分布 B03 在Cluster I、 B05 III、 IV B07 B11 B15
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0
number of OTUs
20
40 60 number of clones
80
100
图3-7 渤海沉积物反硝化细菌nirS基因稀释曲线
三. 实验结果
3.6 多样性指数分析
表3-3 nirS基因多样性指数(AA 5% cutoff) Station B01 B03 B05 B07 B11 B15 H 1/D 47.27 21.12 30.80 E Chao ACE
分 析
根据条带的亮度和清晰度， 选择DNA模板浓度为0.5μl 用于nirS的平行PCR实验。
三. 实验结果
3.3 nirS基因限制性酶切分析
图3-5 PCR产物的HhaI酶切电泳图
图3-4 插入片段nirS基因的扩增PCR电泳图 选择长度正确清晰，亮度适宜的条带用
分 析
于限制性酶切实验 。 根据两种酶HhaI和MspI酶切的条带长 度划分OTUs。 图3-6 PCR产物的MspI酶切的电泳图
27.06
0.86 0.77 0.77
3.06
41(30,80)
42(31,74)
分 析
有以上分析可以看出B01、B05、B07三个站位的多样性指数较高， 而B15站位多样性指数较低 。
三. 实验结果
渤海B01、B05和B07站位反硝 3.7 聚类分析 化细菌群落结构相对较为接 近，B03和B11站位的反硝化 群落距离介于中间，而B15站 3.7.1 UniFrac聚类分析 位反硝化细菌的群落结构的 差异较大 .