中国小麦花叶病毒 CWMV) ( 生物学特性初探
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浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis17(3):155~157,2005
中国小麦花叶病毒(CWMV)生物学特性初探
张巧艳,陈剑平*
(浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021)
Biological properties of Chinese wheat mosaic virus(CWMV)
ZHANG Qiao-yan,CHEN Jian-ping*
(Institute of Virology and Biotechnology,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou310021,China)
关键词:中国小麦花叶病毒;寄主范围;病毒粒子形态学
Key words:Chinese wheat mosaic virus(CWMV);host range;viral morphology
中图分类号:S432.4+.1文献标识码:A文章编号:1004-1524(2005)03-0155-03
山东省烟台冬小麦病区小麦病毒病发生很严重,症状主要表现为花叶、黄化、分蘖增生、僵缩和枯死等。这种病害主要由禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)传播的一种杆状病毒引起。由于病毒粒子形态、病害流行及寄主范围的相似,长期以来,该病毒一直被认为是土传小麦花叶病毒(Soil-borne wheat mosaic virus,SB-WMV)[1]。然而,最近的分子生物学研究表明,它不同于已知的SBWMV,应该是真菌传杆状病毒属(Furovirus)的一个新成员,并被命名为中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)[2]。该病毒通常与大麦黄花叶病毒属的小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)复合侵染,导致更严重的田间病害[1]。本试验研究了CWMV的一些生物学特性,为其进一步研究提供参考依据。
1材料与方法
1.1样品收集和保存
收稿日期:2004-12-30
基金项目:国家杰出青年基金(30225031)
作者简介:张巧艳(1978-),女,浙江浦江人,主要从事植物病毒生物学研究工作。
*通讯作者E-mail:jpchen@
小麦病叶2003年3月采自山东烟台农业科学研究所病田,症状表现为花叶、黄化、分蘖增生等。-80℃冰箱保存备用。
1.2体外稳定性鉴定
致死温度(TIP)、稀释限点(DEP)和体外保存期(LIV)的确定参照文献[3]。
1.3寄主范围鉴定
小麦病汁液摩擦接种3科13种常规寄主植物,包括苋色藜、昆诺藜、墙生藜、曼佗罗、假酸浆、番茄、心叶烟、苯氏烟、三生烟、白肋烟、三生枯斑烟、小麦和大麦,7d后观察症状发展。具体操作参照文献[3]。
1.4电镜观察
用铺有Formver膜的电镜铜网沾取枯斑苋色藜病叶汁液,吸干,用pH7.0的3%磷钨酸(PTA)负染1min,吸干,待干燥后在透射电镜下观察病毒粒子形态。
1.5RT-PCR检测
根据已报道的CWMV序列(AJ012006)设计特异性引物CWMV-CP(+)5’-ACATATGGCCGT-GAAATCTGG-3’和CWMV-CP(-)5’-TGGATCCT-CAACTCGAACCTTCCC-3’用来扩增CWMV的CP 基因全长序列;根据已报道的WYMV序列(AJ131981)设计特异性引物WYMV-CP(+)5’-
GCAGCTGACACACAAACAGA-3’
和WYMV-CP (-)5’-GATGGTTTAGGTTAGTTCTG-3’用来扩增WYMV 的CP 基因全长序列。植物病毒总RNA 抽提、第一链cDNA 合成和PCR 扩增按文献[2,4]
操作。2
结果与分析
2.1
体外稳定性鉴定
小麦病汁液在60℃下水浴10min 失活,该
病毒致死温度为60℃。小麦病汁液稀释100倍后接种苋色藜不出现枯斑,稀释限点为10-2。小麦病汁液4℃无菌条件下保存5d 后不具侵染性,体外保存期为5d 。2.2寄主范围鉴定
将小麦病汁液摩擦接种3科13种常规寄主植物,仅苋色藜、昆诺藜接种叶片上出现明显的局部枯斑(图1),枯斑呈圆型,边缘较模糊。小麦上发生系统侵染,接种初期小麦叶片出现典型的花叶症状,继续培养后出现分蘖增生等。
图1烟台小麦病样接种苋色藜(A )和昆诺藜(B )产生局部枯斑
Fig.1Local necrotic spots in the leaves of Chenopodirm amaranticoal and C.quinoa
2.3电镜观察
电镜下观察到产生枯斑的苋色藜叶片汁液
中含有杆状的病毒粒子(图2),直径约20nm ,长
度为80-360nm 不等,主要分布在150和300nm 附近,短粒子居多。没有发现线状的WYMV 。
图2苋色藜枯斑叶片电镜观察
Fig.2Electron microscopic observation on leaves of C.amaranticolar including local necrotic spots
2.4
RT-PCR 检测
CWMV 经常与WYMV 复合侵染小麦,
为了确证枯斑为CWMV 引起,用特异性引物进行RT-PCR 检测。结果
(图3)显示,小麦病叶、苋色藜、昆诺藜枯斑叶片均能扩增出510bp 条带,与
CWMV 的CP 基因大小相当;
而只在小麦病叶中扩增出了与WYMV 的CP 基因大小相当的900bp 条带。说明山东烟台病区的小麦是CWMV 和
WYMV 复合侵染,
但是摩接后在苋色藜和昆诺藜上产生的枯斑只是CWMV 产生的。
3讨论
影响摩擦接种效率的因素很多。在试验过
1,3,5为引物对CWMV-CP (+)/CWMV-CP (-)扩增产物;2,4,6为引物对WYMV-CP (+)/WYMV-CP
(-)扩增产物1和2为烟台小麦病样;3和4为产生枯斑的苋色藜植株;5和6为产生枯斑的昆诺藜植株。
图3PCR 检测样品中的CWMV 和WYMV 外壳蛋白序列
Fig.3Results of RT-PCR with the primers of CWMV-CP and WYMV-CP
・651・浙江农业学报第17卷(2005)