第七章 定点诱变

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第七章定点诱变

第七章定点诱变

第七章定点诱变第七章定点诱变[本章摘要]突变有重复、缺失、倒位、易位四种类型。

定点诱变主要是关于:简单的插入或缺失,单个碱基的置换以及系统的缺失、插入或成串碱基的置换。

寡核苷酸介导的定点诱变主要是对单个或少数几个碱基的操作;外切核酸酶Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ介导嵌套缺失,可以得到系列缺失体。

第一节:寡核苷酸介导的诱变70年代初j×174 DNA (ss DNA 5386bp),当用带琥珀突变的ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时,观察到“标记获救”现象。

即产生带野生型基因组的噬菌体,原因是野生型DNA 片段与突变体的相应序列退火,形成错配的异源双链体,后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。

由此可利用突变的DNA 片段将突变引入到野生型DNA 中。

一、Kunkel法或称“U” 法1.背景介绍dut-dUTP 酶缺陷,细胞不能把dUTP 转化为dUMP ,因此细胞内dUTP 的含量大为增加,其中一些dUTP 可掺入DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。

ung -UDG 酶缺陷,UDG 酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去掺入DNA 中的尿嘧啶残基。

2.原理Kunkel 法原理如图7-1 所示,过程包括:①当目标DNA 插入phagemid 载体并进入E.coli CJ236 后。

②由于该菌体ung- dut-突变,合成的DNA 上含有少量尿嘧啶(取代胸腺嘧啶)。

③M13K07 辅助感染下,产生带U 的单链DNA 。

④与引入诱变的Oligo 复性。

⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下,以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链,形成杂合双链。

⑥感染dut+ung+ E.coli MV1190 后,在细胞分裂过程中,只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。

福建农林大学-研究生复试-作物育种学-第7章-诱变育种

福建农林大学-研究生复试-作物育种学-第7章-诱变育种

第七章诱变育种一、诱变育种的概念及特点二、物理诱变三、化学诱变四、诱变后代的处理五、提高诱变育种效率的方法一、诱变育种的概念及特点1、诱变育种的概念利用理化因素诱发生物体产生变异,再通过选择育成新品种或新材料的育种方法。

★物理诱变:利用辐射诱发基因突变和(或)染色体变异★化学诱变:应用化学物质诱发基因和(或)染色体变异2、特点(1)优点提高突变率,变异范围广。

突变率可达3%,比自然突变高100-1000倍。

突变类型多,还可能产生新基因。

对单一性状改良有效。

如早熟性、株高等。

多为点突变和隐性突变,易稳定,育种年限短。

●热中子:极早熟大豆哈75-222(早32天)●γ射线:原丰早水稻(早40天)●热中子(印度)蓖麻早150天(270天→120天)●大麦白粉病抗性基因mlo(2)局限有利变异少。

难以综合改良。

诱变的方向和性质尚不能控制。

▪二、物理诱变(一)物理诱变剂的种类及其性质物理诱变剂:各种辐射线。

因此,物理诱变通常称为辐射诱变。

分为:电离辐射线和非电离电离辐射线。

用于作物育种的大多是电离辐射线。

▪1、电离辐射线χ射线(伦琴射线):最早用于诱变的射线。

20世纪20年代利用χ射线诱发玉米、大麦;1934利用χ射线育成第一个烟草突变品种Chlorina●由x光机产生,其能量和穿透力与工作电压有关。

●低电压产生软χ射线,穿透力弱,适于花粉外照射●高电压产生硬χ射线,穿透力强,适合小块组织、愈伤组织的外照射。

γ射线(丙种射线):是一种短波长、能量高、穿透力强的电离辐射线。

目前应用最多。

●农用γ射线由放射性同位素60Co、137Cs产生,需专门的照射室(60Co源室),严密防护,安全。

适于外照射。

●福建2处●厦门大学的佳辐占,农林大的eui水稻。

中子:不带电粒子,穿透力强,可直接进入细胞核内,适于处理种子、植株的外照射。

β射线:带电粒子, 质量小速度快,可以穿透几毫米的组织。

●育种上的β射线由放射线性同位素32P、35S产生。

《定点诱变技术》课件

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本课程将介绍定点诱变技术的原理、实验步骤、应用案例和未来展望,以及 它对人类社会的影响和挑战。
概述
什么是定点诱变技术?
定点诱变技术是一种精准编辑基因术?
传统的基因编辑技术往往是非特异性的,不能达到精准编辑的效果,而定点诱变技术可以 避免对非目标区域的影响。
实验步骤
1
实验前的准备工作
首先需要构建引导RNA分子、购买
细胞培养与转染
2
Cas9核酸酶,以及筛选细胞线等。这 些都需要提前准备。
将引物与Cas9,利用转染技术导入到
目标细胞中,完成复合物的构建。
3
PCR扩增和测序
利用PCR扩增技术检测目标基因组位
置是否发生了修饰,并对其进行测序,
数据分析和结果解读
定点诱变技术的应用领域
定点诱变技术可以应用于基础科研、农业生产、医疗诊断等领域,为人类社会带来了诸多 益处。
基本原理
基于CRISPR-Cas9技术实 现的定点诱变
CRISPR-Cas9技术可以在基因 组中精准识别目标区域,并将 核酸酶Cas9导入到目标位置, 再通过引导RNA分子的作用, 完成对基因组上的目标位点的 修饰。
定点诱变技术可能会带来一系 列的伦理、法律和社会问题, 例如导致人们撕裂不和,社会 不公等问题。
定点诱变技术未来发展 的瓶颈和解决方案
目前,定点诱变技术在某些肿 瘤细胞和人类胚胎细胞中并没 有得到广泛应用,需要进一步 研究,探索更为高效、精准、 安全的定点诱变技术。
4
验证修饰深度和准确性。
对PCR扩增和测序的数据进行分析, 解读实验结果,得出结论,为下一步
的研究提供指导。
应用案例
定点诱变技术在基因 修复中的应用

第七章 诱变育种

第七章 诱变育种

染色体断裂; 基因突变; 细胞分裂异常。
作用于微管蛋白
五、辐射剂量和剂量单位
(一)辐射剂量:单位体积或单位质量的 空气吸收的能量。 (二) 吸收剂量:单位体积或单位质量被 照射物质中所吸收能量的数值称为吸收 剂量。 D=E / M(尔格) D– 辐射剂量 E– 被照射物质吸收的能量 M– 被照射物质的体积
六、辐射材料的选择
(一)选择材料的原则 综合性状好,个别性状有待改善; 杂合子材料; 易产生不定芽; 对辐射较为敏感的材料。
(二)植物对辐射的敏感性 1. 科、属、种的敏感差异; 2. 品种间敏感差异; 3. 不同发育阶段差异; 4. 不同组织器官差异。
(三)影响植物材料敏感性的因素
处理干种子的优点是: 1) 能处理大量种子; 2) 操作方便; 3) 便于运输和贮藏; 4) 受环境条件的影响小; 5) 经过辐射处理过的种子,没有污 染和散射的问题。
2、无性繁殖器官 许多园林植物是用无性繁殖的,而且 有部分园林植物从来不结种子,只依靠无 性繁殖的. 诱变育种是对这类材料进行品种改良 的重要手段,在诱变育种中只要得到好的 突变体,就可直接繁殖利用。
3、温度:在种子受照射后,对种子进行处理, 即在75℃或85℃处理15分钟,此种处理称 “热击”,可以降低照射后在有氧条件下吸水 所产生的敏感性。 4、核体积(包括植物的多倍性):辐射敏感性 与“间期”染色体体积之间呈负相关,即“间 期”染色体体积愈大,辐射敏感性愈小,否则 相反;辐射敏感性亦与DNA含量成负相关,即 DNA含量越多,辐射敏感性越差,所以多倍体 植物比较辐射。
3.
X射线 是由X光机产生的高能电磁波。X射线与 射线很相拟。它的波长比γ 射线长,射程略 近。穿透力不如 γ射线强。

第七章诱变育种

第七章诱变育种
诱变育种的主要目标是选育某种代谢产物合成能力强的高 产突变株,代谢产物生产能力强弱是一种数量性状。 1.遗传变异的质量性状:大多数典型的遗传性状是不连续的, 即不同的基因型产生相当不同的表型,相互之间没有重叠。如 孢子的颜色,形状;荚膜有无等形态特征,营养缺陷型等生理 特征。 2.遗传变异的数量性状:①是一个连续分布内的变化,例如抗 生素、氨基酸、有机酸、核苷酸等微生物代谢产物的生产能力 从高到低的差异是连续性差异。②数量性状是由多个基因的积 累作用所控制,每个基因所起的作用是有限的,③环境条件在 决定表型上起着很大的作用。
第七章诱变育种
②筛选工作有一定的盲目性:由于数量性状的变异是连续的, 选育高产菌株往往缺乏明确的正负效应,造成筛选工作具有一 定的盲目性。 ③诱变育种工作难度较大:产量突变是许多细微突变的多次积
累,高产菌株选育中多采用多步叠加累积诱变选育法。一般 很难一次性得到产量大幅度提高的菌株;单个诱变阶段产量 提高幅度不高,一般仅5-15%,这一幅度与亲本群体的生 产能力波动范围差不多,加上操作误差也很大,有时甚至超 过5-15%,所有这些都增加了诱变育种工作的难度。
(2)诱导解除基因表达抑制的突变。
改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法: (1) 通过确定并改变代谢中的耗能部分; (2) 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 (3) 赋予菌种对多种底物,特别是价廉而丰富的底 物的利用能力,由此可降低操作费用。
第七章诱变育种
第一节 诱变育种的作用和特点
诱变育种:以诱发突变为基础的育种,是迄今为止 国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
第七章诱变育种
诱变
物理、化学或生物诱变方法
第七章诱变育种
一、诱变育种的作用

第七章 诱变育种

第七章  诱变育种

第七章诱变育种诱变育种是利用理化因素诱发变异,再通过选择育成新品种的方法。

第一节诱变育种的成就及特点一、诱变育种的成就二、诱变育种的特点优点1. 提高突变率、扩大突变谱突变率:突变体占总个体数的百分率。

突变谱:各种突变类型组成突变谱。

2. 有效地改良个别性状诱变多为点突变、改变一两个基因,对主效基因控制的性状较有效,如:矮秆、早熟、抗病性。

3. 缩短育种年限诱发的变异大多为一个或少数几个主效基因的改变,稳定较快。

第二节常用物理诱变剂及其处理方法一、物理诱变剂的类别与性质紫外线X射线Γ射线粒子辐射电子束激光离子注入航天搭载航天搭载(航天育种或太空育种)育成的品种:水稻农垦58搭载卫星丰产品系ZR9搭载高空气球航育1号麦类扬麦5号搭载卫星小麦新品系蔬菜龙椒2号搭载高空气球卫星87-2离子束诱变育种离子注入引起生物产生变异,对改良数量性状效果显著。

目前在农作物诱变育种方面,离子注入改良的范围几乎涉及所有主要粮食和经济作物。

育成新品种:水稻品种 D9055和S9042小麦品种皖麦32蔬菜品种鲁番茄7号二、物理诱变剂处理方法(一)诱变处理的材料1、种子2、绿色植株3、花粉4、子房5、合子和胚细胞6、营养器官7、离体培养中的细胞和组织外照射 ---- 种子等所受的辐射来自外部的辐射源。

急性照射----采用较高的剂量率进行短时间的处理。

慢性照射----用钴(或铯)圃,每天将钴(或铯)源升到地面进行一定时间的慢性照射。

内照射---将辐射源引入生物体组织和细胞内进行照射的一种方法。

利用放射性同位素32P、35S、14C或65Zn的化合物,配成溶液进行浸渍种子,或使作物吸收,或注射茎部。

内照射的主要方法:•浸泡法•注入法•施入法•合成法(三)辐射处理的剂量①不同的科、属、种和品种,其辐射敏感性差异很大。

敏感作物:豆科作物、玉米、黑麦中等敏感作物:禾本科作物及棉花钝感作物:十字花科、亚麻、红麻、烟草②不同器官和细胞及不同发育时期、不同生理状况敏感性有差异。

诱变育种

诱变育种
④放射性强度 指放射性同位素单位时间内的核 衰变次数,现国际制专用单位为贝可 (Bg), 原单位 为居里(Ci )
7.2.3 作物对辐射的敏感性
作物对辐射的敏感性是指生物体、组织、细胞 或细胞内含物在一定剂量的射线照射下,在形态和 机能上发生相应变化的大小。
目前常用来测定辐照敏感性的指标有:①生长 受抑制的程度。常以苗高降低到对照的一半所需的 剂量,即半致矮剂量(D50)表示;②植株成活率。 辐照后能达到开花结实完成生命周期植株的百分 数 , 以植株存活一半的剂量,即半致死剂量 (LD50) 表示;③植株不育程度。一般以花粉败育或结实率 的高低和不育株所占百分率表示;④幼苗根尖和幼 芽细胞分裂时染色体畸变率,常用微核细胞率作指 标;⑤以细胞分裂期间细胞核体积、染色体体积作 指标。
7.2.4 诱变处理的材料
诱变处理的材料通常选用本地区大面积推广 应用的适应性和综合性状良好, 而某些性状需要 改良的品种。但是为了同时改良多种性状则以杂 交后代为材料的效果好 , 用诱变因素处理杂种, 不仅可以提高突变频率, 扩大其后代的变异幅度, 而且能够打破不利的基因连锁, 促进基因重组。
诱变处理的对象一般为种子, 但突变率较低, 为了提高诱变频率还可处理萌动的种子、幼苗、 孕穗期植株、雌雄配子、合子等。其中以处理配 子和合子的效果较好, 特别是配子处理最有采用 价值。
②辐射剂量 (X ) 定义为 X 或γ 射线在标准条 件下单位质量的干燥空气中所产生的电荷。单位是 库仑 / 公斤〈 C/kg〉
③剂量率有吸收剂量率 (D )和照射剂量率 (X) 之分。吸收剂量率是指单位时间内受照射物体所吸 收的剂量,单位有戈/小时、分和秒。照射剂量率是 指单位时间内所测干燥空气受照射的剂量 , 单位是 库伦/千克·秒等

教学课件第七章诱变育种

教学课件第七章诱变育种
• 根据照射植物的器官组织不同可分为:种子照射、 花粉照射、子房照射、营养器官照射、植株照射、 其他植物器官组织的照射等等。
内照射:将放射性元素引入植物体内, 由它放射出的射线在体内进行照射。
• 内照射优点:剂量低、持续时间长、多数 植物可在生育阶段进行处理等。
• 方式:
– 浸种法 – 施入法 – 涂抹法 – 注射法 – 在示踪研究的植株上采取种子或枝条等。
适宜剂量和剂量率的选择
• 概念
◎适宜剂量 ◎致死剂量: ◎半致死剂量:
• 剂量的选择原则:
◎活:后代要有一定的成活植株 ◎变:在一定的成活植株中,有较大的变异效应 ◎优:产生的变异有较多的有利突变。
辐射育种的程序
• 处理材料的选择 • 突变世代的划分 • 分离世代群体数量的估计 • 突变体鉴定和选择 • 辐射育种的基本程序
• 试材预处理: • 药剂处理: • 药剂处理后的漂洗:一般约需冲洗10~30
分钟甚至更长时间
试ห้องสมุดไป่ตู้预处理:
• 在化学诱变剂处理前,将干种子预 先用水浸泡,可以提高其对诱变的敏感 性。浸泡时温度不宜过高,通常用低温 把种子浸入流动的无离子水或蒸馏水中。 此外,将材料浸泡在生长素溶液中,有 提高化学诱变的效应。对一些需层积处 理以打破休眠的植物种子,药剂处理前 可用正常层积处理代替用水浸泡。
* 与杂交育种相结合 * 与远缘杂交相结合 * 与离体培养相结合
诱变育种的类别
★物理诱变:利用辐射,诱发基因突变和 染色体变异
★化学诱变:应用有关化学物质诱发基因 和染色体变异
辐射育种
• 诱变源的种类及特性 • 辐射诱变作用的机理 • 辐射诱变的方法 • 辐射育种程序
诱变源的种类及特性

以DNA重组技术进行定点诱变(一)

以DNA重组技术进行定点诱变(一)

因 为 所有 这 些 诱 变 因 子都
D N A
导人 细 胞或 噬菌 体 体 内
是 渗 人 细 胞 内与 的
.
发 生 作用 而 致 变
,
表达
最 后 可 以 通 过特 定 的 甄 别手 段 把 目
.
许多类诱变 因 子的 诱变机理 已探 明
,
的 克 隆子 挑 选 出 来
一 般情 况 下
.
目的 克
如紫 外 线 造 成 嚓 陡
之 间 形 成 二聚 休 配对
, ,
特 别 是 两个 相 邻 的
,
T
隆子


( 即 目的 变 异 株 )
出 现 的 机 率非 常
于 是 此处 不 能与 对 方 链
而 使 下 一 轮 复 制 失 误 导 致变 异
DN A
;

,
上 述 休 系 的 关 键 就 在 于 如何 对 离 体 的
D NA
陡类 化合 物 因 能嵌 人 距增 长

重 组 技 术 进 行 定 点 诱 变

)
(
无 锡轻 工业 学 院
, ,


,
长 期 以来
,
诱 变 一 直是 改 造 微 生 物
的基 因 或 目标 D N A
把这 一
o n
D N A i g
n
片段
t
o
培 养 出人 类 所 需 求 的 优 良 品 种 的 有 效 手 段
u
连 接 在 合适 的 克隆 载 体 ( C l

,
v e e
r
)
利 用 物理 或化 学 因子直 接 处理 微 生物

分子生物学--定点诱变与蛋白质工程课件

分子生物学--定点诱变与蛋白质工程课件
❖ 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂,但由于其只能水解 苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键,底物作用范围过窄而限 制了洗涤剂的高效性,若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位 于活性中心166位的甘氨酸(Gly),所获得的突变酶不仅能水 解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键,而且可以水解酸性氨 基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键,使其底物作用范围拓宽, 因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶,这是定点诱变改变蛋 白质生物学活性的成功例子。
❖ N端-----------笨丙-天冬-----------谷-甘-------------- C端 多肽链
三、定点诱变的原理
定点诱变原理示意图
❖ The Nobel Prize in Chemistry 1993
"for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry"
2.诱变过程
1)合成含有目的 基因的正链DNA; 2)合成含有特殊 突变碱基的引物; 3)制备异源双链 DNA(右图); 4)富集和转化双 链DNA分子; 5)筛选突变体并鉴定
(二)Kunkel定点诱变法
❖ 体外DNA合成往往是不完全的,所以部分合 成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除 去,获得纯化的突变DNA。
❖ 理论上来说,DNA是半保留复制的,应用寡 核苷酸定点诱变时,所形成的噬菌体中携带 突变基因的应为一半。但实际上,由于技术 上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基 因的噬菌体。
❖ 因此,为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌 斑,必须提高突变体的比率。目前已有多种 改良的寡核苷酸定点诱变方法,此处将 Kunkel 1985年建立的方法做以简单介绍。

第七章 诱变育种

第七章  诱变育种

第七章诱变育种诱变育种是利用理化因素诱发变异,再通过选择而培育新品种的育种方法。

第一节诱变育种的成就及特点一、植物辐射诱变育种的主要成就1.诱变育种历史①1927年,Muller在第三次国际遗传学大会论述X-射线诱发果蝇产生大量变异,提出诱发突变改良植物。

②之后,Stadler在玉米和大麦上首次证明X射线可以诱发突变。

③Nilsson-Ehle (1930)利用X射线辐照获得了茎秆坚硬、穗型紧密、直立型的有实用价值的大麦突变体。

④1934年,Tollenear利用X射线育成了第一个烟草突变品种—Chlorina,并在生产上得到了推广。

⑤1948年,印度利用X射线诱变育成抗干旱的棉花品种。

诱变源不断丰富和改进,从早期的紫外线、X-射线到r射线、ß射线、中子和各种化学诱变剂新中国第一个五年科学技术规划中,利用原子能被列为重点发展项目之一。

○11957年,中国农业科学院成立了我国第一个原子能农业利用研究室○21961年成立了原子能农业利用研究所,设立了辐射遗传育种研究室。

○3随后各省也相继成立有关研究机构,为广泛开展诱变育种奠定了良好的基础。

○420世纪60年代中期开始在水稻、小麦、大豆等主要作物上利用辐射诱变育成了新品种,在生产上得到了应用。

到1975年,已在8种作物上育成81个优良品种,种植面积约100万hm2。

(在各种作物上取得成功)2.诱变育种的主要成就辐射诱变育种已经对农业生产作出了巨大的贡献,主要表现在两个方面。

○1育成大量植物新品种a辐射诱变育种的植物种类已相当广泛,几乎遍及所有有经济价值和观赏价值的植物。

(课本)b我国诱变育成的作物品种数量居世界各国之首,种植面积也不断扩大。

辐射诱变育种在农业增产中做出了重要贡献。

(课本)○2提供大量优异的种质资源a辐射诱变可使作物产生很多变异,这些变异就是新的种质资源,可供育种利用。

(课本)b将辐射诱变产生的优良突变体作为亲本用于选育杂交品种是诱变育种的另一用途。

第七章诱变育种mhj

第七章诱变育种mhj
与远缘杂交相结合 与离体培养相结合
诱变育种的类别
★物理诱变:利用辐射等物理诱变因素,诱发
植物产生遗传变异,从中选择和培育新品种 的方法。
★化学诱变:应用化学诱变剂(mutagen)诱发
植物产生遗传变异,以选育新品种的技术。
第一节 辐射育种
诱变源的种类及特性 辐射处理的剂量单位 辐射诱变作用的机理 辐射诱变的方法 辐射育种程序
内照射: 内照射 将放射性元素引入植物体内,由它放射
出的射线在体内进行照射。目前在育种上应用较少
内照射优点:剂量低、持续时间长、多数植
物可在生育阶段进行处理等。
方式:
浸种法 涂抹法 注射法 施入法(饲喂法)
辐射育种的程序
处理材料(部位) 的选择 适宜剂量和剂量率的选择
诱变处理后的选育
突变体鉴定
处理部位的选择
概念
致死剂量: ◎ 半致死剂量: ◎ 临界剂量:

剂量的选择原则:
活:后代要有一定的成活植株 ◎ 变:在一定的成活植株中,有较大的变异效应 ◎ 优:产生的变异有较多的有利突变。

影响选择的依据
作物对辐射敏感性的差异
①不同科、属、种、品种敏感性不同
豆科>禾本科>十字花科
②不同倍数植物敏感性不同
二倍体>多倍体
诱变源的种பைடு நூலகம்及特性
X射线:辐射源是X光机。X射线又称阴极射线, 射线
分为软Χ射线和硬Χ射线,诱变育种一般用硬Χ射线
γ射线:辐射源是60Co和137Cs及核反应堆。 射线
γ射线是一种是一种高能电磁波,穿透力强, 目前常用的照射装置有:钴室,钴圃,钴人工气候辐照室 。
β射线:辐射源为32P和35S。β射线 射线

基因定点诱变

基因定点诱变
2.4.2 寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制,随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子.在异源双链DNA分子 制备时,加入硫代核苷酸,使之掺入突变 链中.然后用前述酶切割,并用外切酶局 部消化后,进行聚合反应,从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
2.4.3 PCR诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡 核苷酸引物诱变能力仅限于5’ 端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补 的带有突变碱基的内侧引物和 2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一 轮PCR产物为第二轮PCR引 物
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第7章 诱变育种

第7章 诱变育种

• 照 射 室:照射源、储源井、升降装置 照射源、储源井、 • 处理对象:植株、种子、组织、器官、愈伤组织、花粉 处理对象:植株、种子、组织、器官、愈伤组织、 (无嵌合体) 无嵌合体)
图7-1 辐照室平面图 1、操作室 2、电动升降 、 、 机 3、地沟 4、安全门 、 、 5、迷道 6、辐照室 7、 、 、 、 水井 8、钴源 9混凝土 、 混凝土 墙 10、门 11、运源洞 、 、
我国诱变种育的历史
• 1957年,中国农业科学院成立了我国第一个原子能 年 农业利用研究室; 农业利用研究室;随后各省也相继成立有关研究机 构; • 20世纪 年代中期开始在水稻、小麦、大豆等主要 世纪60年代中期开始在水稻 小麦、 世纪 年代中期开始在水稻、 作物上利用辐射诱变育成了新品种, 作物上利用辐射诱变育成了新品种,在生产上得到 了应用。 了应用。 • 20世纪 年代后期,植物辐射诱变育种开始应用于 世纪70年代后期 世纪 年代后期, 蔬菜、糖料、瓜果、饲料、药用和观赏植物育种。 蔬菜、糖料、瓜果、饲料、药用和观赏植物育种。 • 育成的品种:9个品种获国家发明奖,包括:水稻原 育成的品种: 个品种获国家发明奖 包括: 个品种获国家发明奖, 丰早、棉花鲁棉 鲁棉1号 大豆铁丰18和黑农 和黑农26等 丰早、棉花鲁棉 号、大豆铁丰 和黑农 等
穿透力远小于r 射线( )、电离密度大 穿透力远小于 射线(mm)、电离密度大 )、 内照射:同位素溶液浸泡、注射处理, 内照射:同位素溶液浸泡、注射处理,常用32P 2、α射线:氦的原子核。穿透力更弱,电离密度更大。 、 射线:氦的原子核。穿透力更弱,电离密度更大。 对有机体内产生严重的损伤 诱发染色体断裂的能力很强。 诱发染色体断裂的能力很强。 3、中 子:用于外照射 中子分为:热中子、慢中子、 中子分为:热中子、慢中子、中能中子 快中子、 快中子、超快中子
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1. 核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ,ExoⅢ)的消化
原理:就是利用核酸外切酶 Ⅲ(ExonucleaseⅢ,ExoⅢ可特异性地切割线 型双链DNA分子3’凹端产生5’突出端这一性 质而进行的一种缺失反应。利用该技术可构 建一系列梯度缺失重组子
A B C
2.BAL 31 的消化
主要活性:3’外切核酸酶活性,可从线性 DNA 两条链的 3’ 端去除单核苷酸。
突变方式: 定点诱变 随机诱变
•易错PCR(error-prone PCR) •DNA重排(DNA shuffling) •体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) •交错延伸(staggered extension process,StEP)
还具有较弱的内切核酸酶活性可降解单链(单 链, nick, gap),依赖 Ca2+ ,EGTA 可抑制活 性子
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3.DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶,可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。
6.纯化质粒,转化大肠杆菌JM109,用氨苄青霉素 筛选
7.必要的话,影印一份平板,鉴定四环素敏感的克 隆子,从而获得突变体
8.再做一轮诱变,修复四环素抗性基因并敲除氨苄 青霉素抗性基因
位点选择诱变原理图
(三)转化子诱变 Transformer Site-Directed mutagenesis
使用了2个寡核苷酸引物
➢一个是用来引入突变的突变引物
➢一个是用来剔除单一酶切位点的
将待突变的DNA片段装载到克隆载体上,该载体上 必须存在单一酶切位点。当这两个引物同时指导 DNA合成时,突变的DNA链将不再含有单一酶切 位点,而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大 肠杆菌,线性化的DNA不能复制,只有突变链保持 环状,可以获得转化子
一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程
三个步骤:
1. 突变寡核苷酸引物的合成:化学合成能与野 生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突 变的寡核苷酸,作为体外合成DNA的引物
2. 由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸, 产生含有预定突变的双链DNA
模板:ssDNA or dsDNA。DNA片段,诱变合 成后克隆到载体上;完整的质粒(<9kb)
设计另一个引物,该引物与上一个引物完全互补。
下图为将某基因的启动子与另一基因的编码序列连接示 意图
基因A 基因B
基因B:引物的5’端部分为基因A的ATG密码 子上游紧邻的序列,3’端则为基因B从ATG 密码子开始的序列
基因A:基因B的融合引物与基因A的融合引 物完全互补
这两个融合引物各自与侧翼引物扩增的产 物有完全同源的序列,可以进行重叠延伸
③ M13K07 辅助感染下,产生带 U 的单链 DNA 。
④ 与引入诱变的 Oligo 复性。
⑤ 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下, 以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链, 形成杂合双链。
⑥ 感染 dut+ ung+ E.coli MV1190 后,在 细胞分裂过程中,只有新合成的 DNA 链才 能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的 子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链,在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下,尿嘧啶被水解,从而 失去作为模板的能力。
包括2个含有突变碱基的反向互补的引物,2个上、 下游通用引物。
整个诱变过程需要3个PCR反应分2轮进行。
第1轮PCR的2个反应分别产生2个含突变位点的 上下游DNA片段,这2个DNA片段的末端互补。第1 轮PCR的产物需要经凝胶电泳纯化。
第2轮PCR将上述2个PCR产物混合,通过末端互补 配对互为引物延伸得到完整的含突变位点的全长 DNA
Mg2+ :独立作用于每条 DNA 链,位点随机。
Mn2+ :大致在同一位置切割 dsDNA ,产生平 端 或 1-2 个核苷酸突出
控制作用时间,可获得在DNA分子上平均切割 一个位点的DNA片段群.
7. 必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点, 或消除靠近诱变点的已有酶切位点,便于诱变后通 过限制酶消化筛选侯选突变子
三、经典DNA定点诱变
70年代初 φ×174 DNA (ss DNA 5386bp),当用带琥珀突变的 ssDNA 与 变性的野生型DNA片段一起转染细菌时, 观察到“标记获救”现象。即产生带野生 型基因组的噬菌体,原因是野生型 DNA 片段与突变体的相应序列退火,形成错配 的异源双链体,后者可被宿主编码的错配 修复系统转变为全长的野生型基因组。由 此可利用突变的 DNA 片段将突变引入到 野生型 DNA 中。
(一)、Kunkel法或称 “U” 法
1.背景介绍 dut-:dUTP 酶缺陷,细胞不能把 dUTP 转 化为 dUMP ,因此细胞内 dUTP 的含量大 为增加,其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正 常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。
ung-:UDG 酶缺陷, UDG 酶[尿嘧啶 (uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除 去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基,产生脱碱基 的位点。含有脱碱基的DNA链不再具备作 为完整复制模板的能力
3. 测序。对突变体DNA进行测序,验证靶点的 突变,确保其它区域没有发生额外的突变
二、诱变寡核苷酸引物的设计
设计原则:
1. 与靶DNA的适当链互补,与靶的其它区域不能错 误杂交
2. 足够的长度与靶序列特异结合,1-2个碱基改变的 引物要求至少25bp长
3. 错配碱基位于中央位置,使每侧有10-15bp与模板 链完全配对。有效引入多于3个核苷酸突变时,要 求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补
2). 诱变的效率
提高诱变效率是以PCR为基础的定点诱变面 临的问题。
通过PCR条件的优化、不同Tm值的引物的 巧妙的设计、不对称扩增、把引物标记上生 物素分离突变DNA等手段可以提高诱变效率。
PCR定点诱变方法的不断创新和发展使得分 子生物学关于基因和蛋白质的结构与功能的 基础研究和基因工程中定点改造目的基因更 加简便、高效、低耗。
第四节 嵌套缺失
嵌套缺失(Nested Deletions)的制备主要依赖核 酸酶,如核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ),BAL31或DNaseⅠ,这些 酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化 DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失 和多组终末端相差无几的缺失体
利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此 可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位, 用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动 子和增强子等顺式作用元件
突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 p176
基因的定点诱变(site-directed mutagenesis): 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱 基发生取代、插入或缺失突变的过程
需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为 引物进行DNA复制,使寡核苷酸引物成为新合 成的DNA子链的一部分
Picard V,1994和Song-Hua Ke,1997等分别建立了单管 大引物PCR(Single-tube megaprimer PCR)。单管大引 物法省去第1轮PCR产物的纯化过程,实现在同一管 中先后进行两轮PCR反应。Song-Hua Ke提出的方案 更加巧妙简单。
需设计Tm值不同的2个侧翼引物,第1轮PCR反应用 低Tm值的侧翼引物(F1)和诱变引物,用较低的退火温 度,扩增反应产生大引物。然后再加入高Tm值的侧 翼引物(F2)在较高的退火温度下进行第2轮的反应, 扩增出全长的含突变位点的DNA产物。
基因A P2
P1
基因B
5. 大引物PCR诱变法
大引物PCR法由Kammann M等人于1989
年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加 以改进。
该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物, 经过2轮PCR获得突变的全长DNA。
第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增 产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼 引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。
4. 5’端与模板完全互补,从上游引物起始的DNA合成 不会取代诱变寡核苷酸,DNA聚合酶的5’→3’外切核 酸酶活性是造成上游DNA合成取代5’核苷酸的原因
5.诱变寡核苷酸引物3’区域有10-15bp与模板链完全配 对,形成足够稳定的杂交分子,有效地从诱变寡核 苷酸引物3’端引发DNA的合成
6.无回文、 重复或自身互补序列,否则,形成二级结 构,与靶序列杂交率降低,导致得不到突变体
制备单链DNA模板时用ung- dut-突变的大肠 杆菌菌株如CJ236菌株,该菌株合成的 DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如 M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶
2.原理 Kunkel 法过程包括:
① 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。
② 由于该菌体 ung- dut- 突变,合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶(取代胸腺嘧啶)
第七章 DNA定点诱变
Site-directed mutagenesis of cloned DNA
突变是研究基因结构与功能的最基本的手段
经典的方法:分离自发突变体
用物理、化学诱变剂处理活体
诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限
体外诱变(in vitro mutagenesis):对克隆化的 DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到 的所有种类的突变
(二)位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System
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