拉米夫定耐药HBV毒株的RT区序列分析

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Chinese Hepat ology, June 2003, Vol 8, No. 2
#论 著#
拉米夫定耐药 毒株的 RT 区序列分析
张继明 尹有宽 卢清 张清波 邬祥惠 翁心华
= 摘要> 目的 分析拉米夫 定耐药 HBV 毒株部分 RT 区序列, 以了解 RT 区 YM D D 基序之 外 HBV 的 变异情况。 方法 采用 P CR 方法对拉米夫定临床耐药患者治疗前及耐药后血清 HBV 部分 RT 区序列进行扩增, 扩增 的核苷酸片段 覆盖 HBV RT 的 B 区~ E 区及 S 基因/ a0 决定簇, 对 PCR 产物进行直接测序, 将 HBV RT 区核苷酸和推导 的氨基酸序列 与治 疗前 50 株 HBV 野毒株序列和 Genebank 中 77 株不同基因型野毒株序列进行比较, 同时对 HBV 进 行血清分型 。结 果 60 例患 者 有 YM DD 变异, 其 中 26 例 为 adw 亚 型, 占 43. 33% ; 34 例 为 adr 亚型, 占 56. 67% 。 另 外 12 例 患 者 ( 16. 67% ) 未发现 YM D D 变异。16 例患者出现 11 个 RT 保守区氨基酸变异( 不包括 550 和 526 位氨基酸变异) ; 25 例患 者出现 19 个 HBV RT 非保守区氨基酸变异。结论 拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅见于 RT B 区的 526 和 C 区 550 两个位点, B、C 区的其他位点、保守区以及 RT 非保守区也可发生多个变异。
= 关键词> 乙型肝炎; 拉米夫定; YM DD 基序变异
Analysis of partial RT region sequences of lamivudine- resistant HBV strains from patients with chronic hepatitis B ZH A N G Jiming , YIN Youkuan , L U Qing , et al . H uashan H osp ital , Fudan Univer sity , S hanghai 200040
二、病毒学检测
肝脏 2003 年 6 月第 8 卷第 2 期
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血清 HBV DNA 定量采用荧光定量 PCR 方法, 药 盒购自达安公司, 在 PE5700 扩增仪上进行操作。
三、HBV RT 区序列扩增和测序 根据 HBV P 基因的保守区序列, 自行设计一对引 物。扩增的核苷酸片段, 覆盖 B 区~ E 区。引物序列 如下: 上游引物: 5c- GT A T GT T GC CCG T T T GT C CT C-3c ( nt 461 ~ 481) ; 下 游 引物 5c- CCT T GA CAT ACT T T C CAA AT A- 3c( nt 997~ 974) , 引物由上海申 友公司合成。血清 HBV DNA 的提取按文献进行[ 3] 。 PCR 的反 应体 积 为 50Ll, 反应 条 件是 94bC 预 变性 3min; 94bC 30s, 56bC 30s, 72bC 45s, 循环 35 次, 最后 72bC 7min。取 P CR 产物 5Ll 进行琼脂糖凝胶电泳, 对 扩增产物进行初步鉴定。阳性的 PCR 产物纯化后, 直 接在 ABI377 型 DNA 自动 荧光测序 仪上进行 测序。 测序标本共 122 份, 其中拉米夫定耐药株序列 72 份, 治疗前野毒株序列 50 份。 四、HBV 参照序列 参照序列包括 GeneBank 中不同基因 型 HBV 全 基因序列 77 份; 从治疗前临床标本中获得的序列 50 份。截取 H BV 全基因序 列中两条引物之间序 列, 用 于序列分析。 五、HBV 血清分裂 由于 HBV 的 S 基因完全与 P 基 因重叠, 而本文 设计的 P 基因引物的扩增片段包括 S 基因的/ a0决定 簇, 因而可用于 H BV 血清分型。根据 S 基因 122 位氨 基酸的赖氨酸/ 精氨酸 ( AAG/ CGG) 判断 d/ y 的特异 性; 以 S 基因 160 位氨基酸的赖氨 酸/ 精氨 酸( AAA/ AGA) 判断 w / r 的特异性。 六、拉米夫定耐药 H BV RT 区序列分析 核苷酸序列分析采用 NT I Vect or 5. 5 分析软件, 将拉米夫定耐药患者 HBV RT 区核苷酸序列、推导的 氨基酸序列与慢性乙型肝炎患者拉米 夫定治疗前及 GeneBank 中不同基因型 HBV RT 区核苷酸序列和推 导的氨基酸序列进行比较, 以发现 RT 区内可能与拉 米夫定耐药有关的新的氨基酸变异。
材料与方法
一、病例和标本
作者单位: 200040 上海 复旦大学附属华山医院
病例为 2000 年 10 月至 2002 年 5 月在我院门诊 治疗及随访的慢性乙型肝炎患者, 共 72 例, 全部符合 2000 年西安会议 制定的慢性乙 型肝炎的诊断 标准。 患者接受拉米夫定治疗 1~ 5 年, 平均 1. 5 年, 并符合 临床耐药诊断标准: ( 1) 血清 H BV DNA 转阴后又出 现 HBV DNA 反跳, 至 105 拷贝/ m L 以上; ( 2) 排除拉 米夫定治疗过程中患者依从性差而引起的 HBV DNA 反跳; ( 3) 排除其他原因引起的 AL T 升高。32 例患者 用非基因测序方法( RELP 、基因芯片、荧光 PCR 等方 法) 检测出 YMDD 变异。所有患者留取出现耐药时的 血清标本, 其中 50 例患者留有治疗前标本。血清标本 于- 70bC 冰箱内保存。
结果
一、血清 H BV DNA 水平 72 例拉米夫定耐药患者 HBV DNA 水平平均为 ( 6. 09 ? 0. 12) Log , 拉米夫定治疗前 HBV DNA 水平 为( 7. 83 ? 0. 24) Log , 耐药后 HBV DNA 水平低于治 疗前( P < 0. 05) , 但有 5 例拉米夫定耐药患者的 HBV DNA 水平高于治疗前。 二、HBV 血清型
= Abstract> Objective T o analyze the partial RT r eg ion sequences of lamivudine- resistant HBV strains from patients w ith chronic hepatitis B and to evaluate the amino acid v ar iances outside HBV YM DD mot if. Methods 72 patients w ith chronic hepat itis B treated by lamivudine for ov er 1 y ear were included in the study. All the pat ients had breakthrough of serum HBV DNA lev els and AL T flare up and were clinically diagnosed as being lamivudine- resistant. Partial RT regio n sequences of lamivudine- resistant HBV strains and pretreatment HBV wild strains w er e amplified by PCR using specific primers flanking B- C r eg ions o f R T and / a0 determinant of S gene. Nucleotide and predictive amino acid sequences w er e compar ed w ith wild- ty pe HBV sequences from pretreatment serum samples and Genebank. Results YM DD mutations occurred in 60 patients w ith chronic hepatitis B, 26( 43. 33% ) w ith seroty pe adw, 34( 56. 67% ) w ith serotype adr , the rest of the patients ( 16. 67% ) had no YM DD mutation. 11 amino acid variances in conserved r eg ions of RT other than variances at amino acid position 550 and 526 were found in 16 patients. An additio nal 19 amino acid var iances in non- conserved regions of RT w ere also detected in 25 patients. Conclusion L amivudine- resistant HBV strains may harbor several amino acid v ar iances, not only in the no n- conserv ed r eg ions o f R T , but also in the conserv ed regions outside YM DD motif.
= Key words> Hepatitis B; Lamivudine; Y M DD motif mutat ion
近年来, YMDD 基序 之外变 异的研 究受到 了重 视。已 发 现 RT 保 守 区 的 其 他 变 异, 如 A527T 、 A 546V 、V 553I 变异也与拉米夫定耐药有关[ 1] 。此外, RT 非保守区的 某些变异可补偿 YM DD 变异株的低 复制能力, 导致 Y MDD 变异株复制增强[ 2] 。本研究通 过分析临床上获得的拉米夫定耐药 HBV 毒株部分 RT 区序列, 并与拉米夫定治疗前的野毒株序列进行比较, 以了解 RT 区 YMDD 基序之外 HBV 的变异情况。