实验一纤维素的微生物降解(精)

实验一纤维素的微生物降解

[实验目的]

(1) 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生

物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。

(2)了解纤维素分解的基本理论，并掌握有关纤维素好氧和厌氧分解的一些基本实验技

术。

[实验原理]

1. 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离

与纯化

2.常用的分离纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划

线法等。稀释涂布平板法的步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法的步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。

3.测定纤维素分解酶，可观察其对提供的唯一碳源滤纸纤维的分解情况确定。如果滤

纸溃烂，说明有纤维素分解菌的作用。

4.纤维素分解微生物可根据需氧的与否分为两大类：好氧分解微生物和厌氧分解微生

物。

[实验材料]

1. 培养基

A. 赫奇逊液固体培养基（好氧）：KH2PO4 1.0g，MgSO4٠7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2 0.1g，NaNO3 2.5g，蒸馏水1000ml，pH值为7.2～7.3，0.1MPa灭菌20min。

B. 厌氧液体培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨2.5g，水1000ml，CaCO3 2.0g；0.1MPa灭菌20min。

2. 器材

1.近1mm粒度菜园土。

2.镊子，无淀粉滤纸，1ml和10ml无菌吸管，无菌水，天平。

[方法步骤]

1. 土粒法分离纤维素的好氧分解微生物

1.采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5～15cm处的土约10g，

盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好、标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

2.将赫奇逊培养基趁热倒入培养皿，冷却后加直径近于培养皿的滤纸一张，用少量培

养液润湿。

3.在滤纸上等距放10个近1mm粒度的土粒，28～30℃静置培养。

4.在每隔2d直到7d后，观察并记录土粒周围滤纸变色情况。

5.当出现黄或棕绿色斑时，挑取少许不含土粒的变色纤维制片镜检，初步观察分解纤

维素的细菌、真菌和放线菌。

6.计算各类微生物的土粒占总土粒的比例。

2. 液体稀释法分离纤维素的厌氧分解微生物

1.制备土壤稀释液10-1～10-5。每个稀释度接种于1管培养基中，每管接种1ml。于

28～30℃培养静置培养一周。

2.取出滤纸条，检查溶解区并观察有无菌落生长。若有厌氧性纤维素分解菌生长，滤

纸上常有黄、褐或黑塞斑，滤纸条一摇动即破裂。

3.由检查得出的数量指标，求出厌氧性纤维素分解菌的近似数并换算成每克干土中的

数量。

[结果与分析]

1、好氧纤维素分解菌

编号土粒总数滤纸变色土粒

滤纸呈现颜色菌种

数

1 10 4 黄色、淡红色细菌、霉菌

2 12 5 带亮点的黄色分泌粘液细菌

3 10 7 黄色、灰绿色细菌

4 1

5 10 黄色细菌

2、厌氧菌纤维素分解菌

编号接种浓度颜色现象

1 10-

2 灰绿（最深）上层有絮状漂浮，漂浮物部分分散，

滤纸弯曲

2 10-

3 灰绿（较淡）上层有絮状漂浮，底部有白色纤维

素分解物，滤纸弯曲

3 10-

4 灰绿（较淡）上层有絮状漂浮，滤纸未见明显变

化

4 10-

5 灰绿（较淡）溶液较清亮，有少许絮状沉淀

[注意事项]

1.土粒法中，在出现变色斑后应当尽早观察菌体形态，同时可以转接到新的培养基滤

纸上进一步培养。

2.厌氧分解纤维素时，必须将滤纸条浸入深层环境。

五、思考题

1. 在纤维素分解实验中，深层滤纸为何变色？

答：深层滤纸周围存在大量纤维素的厌氧菌，变色可能是因为菌体分解纤维素产生一些产物或次级代谢产物的氧化底物.