发光细菌法急性毒性实验课件PPT

发光细菌的培养：
(1)培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g， NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，加蒸馏水至 1000ml,pH调至7±0.5，趁热分装于150ml三角瓶中，每瓶约
表1 氯化汞工作液稀释配制系列(稀释至50 ml容量瓶中)
氯化 汞工 作液 体积 ，ml
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
配制 氯化 汞浓 度， mg/L
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
2. 明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个 月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800 万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光，可在暗室内检验，肉 眼可见微光， 稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于 1.6万个细胞(5毫升测试管)或2万个细胞(2毫升测试管)。在 DXY-2型毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1900 mV之 间，低于600 mV允许将倍率调至“X2”档，高于1900 mV允 许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发 光细菌的毒性实验在美国Maxwell（MSI.） LuminMax-C 冷 光仪完成。
发光细菌的复苏
从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置 于含有冰块的小号保温瓶，用1 ml注射器吸取0.5 ml冷的氯化 钠2.0 g/100 ml溶液(适用于5ml的测试管)或1 ml 冷的氯化钠2.5
％溶液(适用于2 ml的测试管)注入冻干粉中，充分混匀。2 min
后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。
实验原理
发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发 光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物 等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓 度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来 受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光 反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如 细胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线 性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大 小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。
发光细菌法急性毒性的测定
主要内容
一、 简 介 二、实验目的与内容 三、实验原理 四、实验材料与方法 五、实验步骤
六、注意事项
七、习题与思考
简 介
发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起
的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒 性的新方法。 1978年美国 Beckman 公司即推出功能完备的生物发光 光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界 范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为 Microtox测试。
图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由α、β 2个亚基组 成，α为40000~42000D，β为37000~39000D。单独α、β亚基均无发光活性， 只有α、β共存时才有活性。E2: NADH：FMN氧化还原酶，分子量为 3000D，对FMN有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。
简 介
采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物 毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。 该方法快速、
简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评
价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。 1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光 菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。
g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5℃冰箱备用，保存
期6个月。
氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml
入1000 ml容量瓶，用3.0 g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液
管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml入250 ml容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶， 然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L溶液按表1 稀释成系列浓度(稀释至50 ml容量瓶中)。配制的稀释液保存 期不超过24小时。
实验材料与方法
1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。 氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)
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氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。
氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存 良好的无结晶水氯化汞0.1000 g于50 ml容量瓶中，用3.0
实验目的与内容
一、实验目的
1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；
2. 根据发光细菌发光强度的变化判断
受试化合物的毒性；
3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
二、实验内容
1. 发光细菌的复苏；
2. 发光细菌发光强度的测定；
3. 受试化合物毒性的计算。
实验目的与内容
发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正 常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程 是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。 发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可 简单概述为： FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH （1） 这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体 内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生 化反应，反应的结果便产生光。
NAD E2 NADH
+
FMNH2 O2 FMN H2O2 E1
E1 FMNH2 RCHO
O2
E1 FMNHOOH NADPH RCHO E3 RCOOH
E1+FMN+H2O2
E1 FMNH2 RCHO NADP+
E1 FMN 呼吸产能 H2O2 E1 FMN HOH hv RCOOH
O2 E1 FMNHOOH RCHO (Lump)