重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究

重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究
摘要
基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。

本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。

提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。

关键词：基因工程菌；质粒；稳定性
-I-
Study on the stability of plasmid of recombinant
human IL-2 E.coli bacteria
Abstract
Escherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.
Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability
-II-
目录
摘要 (I)
ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)
1 材料与方法 (3)
1.1试验材料 (3)
1.1.1 菌种质粒 (3)
1.1.2 培养基 (3)
1.1.3 常用药品 (3)
1.1.4试验仪器 (3)
1.2试验方法 (3)
1.2.1 基因工程菌的转化 (3)
1.2.2 制平板 (3)
1.2.3 连续传代 (3)
1.2.4 鉴定 (4)
2 结果与分析 (6)
2.1不同代菌的传代结果 (6)
2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)
2.3不同代质粒的酶切图 (9)
2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)
3 讨论 (11)
3.1分析本试验所出现的问题 (11)
3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)
3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)
3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)
3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)
3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)
4 结论 (14)
参考文献 (15)
致谢 (17)
-III-
前言
随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。

白细胞介素-2(IL-2)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，它能够有效地提高免疫功能，医学上已用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的疾病，如肿瘤[1]等；在兽医方面因其能提高疫苗的免疫效果[2]，尤其是在基因工程亚单位苗的免疫效果而倍受重视，展现出广阔的应用前景。

IL-2是一种最早发现的具有广泛生物活性的细胞因子，在1979年第二届国际淋巴因子会议上正式命名，它必须和IL-2受体结合才能发挥生物学效应[3]。

人的白介素2 产生细胞有末梢血淋巴细胞、脾细胞、扁桃腺细胞、骨髓细胞和人白血病来源的传代jurkat 细胞系。

天然的人IL-2是由约133的氨基酸残基组成的多肽，它是分子量约为15000的糖蛋白。

白介素的生物学作用以刺激T细胞增生为主，除此之外还有其他重要功能，如促T 细胞增殖，维护整个NK细胞的活化、分化和增殖，调节NK细胞保持它的自然杀伤力，诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖，诱导淋巴因子活化淋巴细胞产生，促B细胞增殖分化作用，以及与其它白介素等的协同作用[4]。

1985年鼠IL-2cDNA，首先克隆成功，建立活化的鼠T细胞系cDNA文库，建库所用载体含有SV40早期启动子，转染COS-7细胞后，使插入片段高效表达，表达后检测细胞培养上清液的IL-2活性，筛选出3个具有IL-2活性的cDNA克隆人IL-2(hIL-2)克隆成功于1986年[5]。

用ConA诱导人的白血病T细胞系Jurkat-111分泌IL-2，然后提取mRNA注入蛙卵进行体外翻译，建立cDNA文库，再将重组质粒DNA转移到硝酸纤维膜上，用mRNA 与之杂交，回收吸附于膜上的mRNA，再进行体外翻译，从而克隆了第一个hIL-2cDNA。

同年，牛IL-2(bIL-2) cDNA克隆成功，建立活化牛淋巴细胞cDNA文库[6]后，用hIL-2cDNA 探针进行筛选。

成熟IL-2含有135个氨基酸，分子量为15.42kD，与人和鼠的IL-2各有65％及50％的同源性。

李祥瑞于1995年用真核表达系统成功克隆了鸡IL-2，并获得高活性重组鸡IL-2[7]。

采用SPF鸡脾脏T细胞，体外诱生IL-2，经生物学活性检测确认细胞培养上清中具有IL-2的生物学活性，提取诱导过的脾单核细胞的总mRAN，反转录合成cDNA，将核酸片段与质粒载体连接，质粒转化宿主菌DH10B，建立cDNA文库。

所用质粒载体为穿梭质粒pSV·SPORTI，它既能在大肠杆菌内增殖，又带有SV40，复制原点及早期启动子，能在COS-7细胞中瞬时表达，表达产物经生物学活性检测，证明其有IL-2活性，经过两轮筛选，共获得14个阳性克隆。

经序列分析表明，鸡IL-2与人和其它哺乳动物IL-2cDNA同源性在50％左右。

作为免疫治疗剂Weinberg报道，多次使用IL-2可以明显降低试验性感染豚鼠生殖系统单纯疱疹病毒感染的复发率[8~10]。

Tellz等报道，使用鸡ConA活化T细胞诱导产生的细胞因子，可使鸡肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)器官侵入率降低51％~60％[11]，此种细胞因子注入鸡胚，同样可以降低孵化期鸡胚的沙门氏菌器官侵入率。

Quiroga等报道，将重组牛IL-2注入牛乳房，可以明显降低细菌性乳房炎的发病率[12]。

构建新型基
-1-
因工程苗Ramshaw等、Flexner等先后报道将小鼠或人IL-2cDNA与含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重组，获得表达IL-2的重组病毒[13]。

将这种重组病毒与不含IL-2基因的痘病毒同时接种裸鼠，结果显示，IL-2的插入并不影响HA的表达水平及免疫原性，但可以防治对裸鼠的致死。

说明插入细胞因子可以大大提高活病毒载体的安全性。

Hazama 等将IL-2基因与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白D基因融合，真核细胞内表达融合蛋白[14]。

免疫小鼠后攻毒，结果该融合蛋白可以完全保护小鼠免疫病毒攻击，而以氢氧化铝为佐剂但不含IL-2的重组糖蛋白只产生部分保护，IL-2在体内的半衰期也因此延长大约4倍。

表明采用此种方式可获得IL-2抗原重组蛋白，是研制新一代基因工程苗的另一途径。

作为免疫增强剂目前亚单位苗是疫苗研究的热点，但亚单位苗只能对寄生虫产生部分保护力[15]，许多兽医工作者把注意力集中到亚单位苗所需的免疫增强剂(Immunopotentiator)上。

重组细胞因子能明显提高细菌、病毒和寄生虫疫苗的免疫效果。

细胞因子免疫增强剂不同于以往的化学佐剂，它们能调节动物对疫苗的反应（包括免疫细胞向接种部位移动，抗原提呈），促进Th细胞的产生、B细胞的成熟和分化，激活（包括NK细胞、嗜酸性细胞和肥大细胞在内的非特异性杀伤细胞）杀伤细胞[16,17]。

重组人IL-2能提高伤寒杆菌活苗和荚膜多糖亚单位苗的免疫效果[18]；重组牛IL-2与牛疱疹病毒I型活苗一起使用，血清中牛和抗体滴度比单独使用疫苗组提高6倍，用牛疱疹病毒糖蛋白亚单位苗免疫牛，并注射IL-2，可显著提高特异性抗体滴度、特异性细胞毒反应和特异性淋巴细胞增殖反应[19]。

重组牛IL-1、IL-2能促进牛病毒性腹泻死苗的免疫效果，IL-2分别于狂犬病疫苗或疟疾疫苗联合使用，对相应抗原的攻击有保护作用。

微生物应用和研究方面重组工程菌中质粒的稳定性对于有效发挥基因工程菌的作用及大规模发酵和产物制备至关重要，因而受到广泛的重视。

近年来，许多学者对大肠杆菌工程菌、酵母菌工程菌及棒杆菌工程菌的遗传稳定性从不同的角度进行了研究。

依据重组质粒的变化本质，可将其不稳定性分为两种类型，一种是因质粒在细胞分裂时的缺陷分配导致质粒丢失而引起的，称为“分配性不稳定”；另一种是因重组质粒DNA的缺失、插人或重排而引起，称为“结构不稳定”[20]。

菌种遗传稳定性的差异决定了菌种的保存方式与传代次数，具有重要的实际指导意义。

-2-
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1菌种质粒
大肠杆菌BL21(DE3)，质粒是pET32a-IL2.
1.1.2 培养基
LB培养基：酵母抽提物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g.
1.1.3 常用药品
酵母抽提物、蛋白胨、NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2、甘油、氨苄青霉素
1.1.4 试验仪器
Avanti@J-E高效离心机、Ldzx-40BI型自动立式压力蒸汽灭菌器、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、干燥箱、UV754紫外分光光度计、蛋白质电泳系统、核酸电泳系统、凝胶成像仪、普通天平、分析天平、微量取液器、冰箱、恒温水浴锅等。

1.2 试验方法
1.2.1 基因工程菌的转化
pET32a-IL2质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，诱导表达进行外源基因表达鉴定。

1.2.2 制平板
将1000 ml含l. 5％琼脂的LB培养基灭菌后冷却至60℃加入100mg／L氨苄青霉素，均匀倒入若干个直径为12cm的平皿中静置冷却，标记为LB(+)；另一组平板的操作方法相同，仅培养基中不含有氨苄青霉素，标记为LB(-)。

1.2.3 连续传代
从长有并经过鉴定的重组菌[pET32a-IL2 BL21（DE3）]的平板上挑取4个菌落，分别接种在4个试管中，这4个试管分别标记为1、2﹑3﹑4。

把这4个试管放置在37摄氏度恒温箱震荡培养24小时（第1代），然后分别在具有标记的4个试管中分别吸取适量菌液接种在LB（+）和LB（-）平板上对应的1﹑2﹑3﹑4区。

然后对4个试管中的菌液继续传代，并且也在24小时之后吸取适量菌液做上述重复试验，对在LB（-）上能长，
-3-
而在LB（+）上不能长的试管菌可以弃用，但也可以继续传代，其他的试管中的菌可以按前述步骤继续传代，一直传50次，并且在此期间每隔5代取出一定量的试管菌种，进行冷冻保藏，在传完50次后，对这些不同代上的菌进行质粒抽提，并进行酶切电泳分析。

1.2.4 鉴定
1.2.4.1酶切分析
在传代过程中若出现仅在LB(-)上生长而在LB(+)上不能生长的菌落对该菌落进行培养，抽提质粒并进行NdeI和SalI双酶切电泳鉴定，若无此现象出现，则每隔5代，从当天的平板上任意挑取单菌落接种到2管LB培养基中，一管培养好后抽提质粒并进行NdeI和SalI双酶切电泳鉴定，另一管用于诱导表达外源蛋白。

1.2.4.2 表达产物的检测
样品的制作：取400µl菌液于Ep管中4000r/min离心3min收集菌体，将Ep管中的废液倒掉，每个EP管中加入75µl的纯净水，将Ep管中的菌块完全悬浮于纯净水中，然后向每个Ep管中加入等体积的加样缓冲液，摇匀后将Ep管放在漂中浸入沸水中煮8-10分钟，然后取出放入离心机中4000r/min，离心半分钟，离去细胞碎片。

1.各种溶液及胶的制作过程：
(1) SDS-PAGE工作液的配制
○15倍电极缓冲液（1000ml）pH8.3
SDS 5 g，Tris 15.1 g，Gly 94 g 超纯水定容。

○2下胶缓冲液（200ml）pH8.8
Tris 36.34 g，HCl 4.35ml或5ml，10％SDS 8ml 超纯水定容。

○3上胶缓冲液（200ml）pH6.8
Tris 12.12 g，HCl 8ml，10％SDS 8ml 超纯水定容。

○430％丙烯酰胺（500ml）
丙烯酰胺150 g，NN-甲叉双丙烯酰胺，超纯水定容，Waterman 1号滤纸过滤。

○5考马斯亮蓝R-250染色液（1000ml）
甲醇45 ml，纯水45 ml，乙酸10 ml，考马斯亮蓝R-250 0.25 g，Waterman 1号滤纸过滤。

○6脱色液（1000ml）
甲醇100 ml，冰乙酸209 ml 纯水定容。

○7加样缓冲液pH6.8
Tris 50mM，DTT 10mM，2％SDS，0.1％溴芬兰，10％甘油。

○8凝胶配方
-4-
下胶上胶胶浓度10 15 20 —
超纯净水（ml） 3.75 2.22 0.75 3.11
上/下胶缓冲液（ml） 2.25 2.25 2.25 1.25 30%丙烯酰胺（ml） 3 4.5 6 0.6 TEMED（µl）25 25 30 20
10%APS（µl）75 75 100 20 (2) SDS-PAGE胶的制作
将皮条沿着玻璃槽固定好，然后压上玻璃片，固定于电泳架上。

将下胶按上面的配方及加入顺序配好用微量移液器注入两玻璃板之间，当加入约5.5ml后加入纯净水，使水面与玻璃板齐平。

约35分钟后，将上面的水倒出，并按上面的配方及加入顺序配好上胶，用微量移液器注入两玻璃板之间，当液面与玻璃板齐平时，将梳子的光面对着自己放下梳子，约30分钟后即可拿出梳子。

注意：制好的胶中不要有气泡，以免影响试验的结果。

2.表达产物的检测：
将1.2.4.1中的另一管于37摄氏度培养至A600=1.2，加入IPTG至终浓度1mM（因为pET32a控制表达外源基因的启动子是T7启动子）诱导表达4h，离心收集菌体，利用15％SDS-PAGE检测表达产物。

-5-
- 6-
2 结果与分析
2.1 不同代菌的传代结果
第1代 第5代
第10代 第15代 第20代 第25代
-
7-
图2-1 不同代菌
通过图2-1我们能大致知道工程菌在LB （-）和LB （+）平板上都能生长且形态相似，这初步说明了基因工程菌质粒的遗传稳定性。

第30代 第35代 第40代 第45代 第50代
- 8-
2.2 上述不同代质粒的电泳图
图2-2 不同代质粒电泳图
注：0代表Mark 2代表第5代 3代表第10代 4代表第15代 5代表第20代
6代表第25代 7代表第30代 8代表第35代 9代表第40代 10代表第45代 11代表第50代
从图2-2的结果可以发现不同代质粒电泳图的平行性，也就是在一定程度上说明了基因工程菌在选择压力下具有遗传稳定性，并可以通过这个图为酶切提供依据。

0 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 5000kDa
3000kDa
2000kDa
1500kDa
800kDa
500kDa
300kDa
100kDa
2.3 不同代质粒的酶切图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
图2-3 不同代质粒酶切电泳图
注：1代表第1代2代表第5代3代表第10代4代表第15代5代表第20代6代表第25代7代表第30代8代表第35代9代表第40代10代表第45代11代表第50代
可以通过图2-3发现质粒的酶切片段的在凝胶中的位置大致一致，可以模糊的说明质粒的遗传稳定性，但理论上应该会有两条明显分开的条带，但这个图给予的解释不是很完美。

-9-
- 10-
2.4 诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳 图
图2-4 不同代外源基因蛋白电泳图
注：0代表Mark 1代表第1代 2代表第5代 3代表第10代 4代表第15代
6代表第25代 7代表第30代 8代表第35代 9代表第40代 11代表第50代 图2-4中marker 在聚丙烯酰氨凝胶中出现了5条带，诱导表达的外源基因的蛋白分子量介于14.4kDa 到20.0kDa 之间，而IL-2的分子量大约在15.0kDa ，从而说明携带外源基因的质粒的遗传稳定性。

0 1 2 3 4 6 7 8 9 11
26.0kDa
20.0kDa
14.4kDa
45.0kDa 35.0kDa
3讨论
3.1分析本试验所出现的问题
(1) 在进行传代50次的中间每隔5代进行拍照得到的一组工程菌的传代的形态图组中，它们都能在LB(-)和LB（+）的平板上同时长出菌，并且形态相似，这些初步说明基因工程菌在选择压力下，具有一定的遗传稳定性。

(2) 在进行不同代质粒的电泳时，第一代没有进行鉴别电泳，而11号孔也就是第50代的质粒不能在电泳中显示出来，可能存在两种情况：第一，存在质粒丢失显现；第二，可能在电泳之前没有对菌液摇匀后再离心，而是直接取得上面清澈部分的菌液进行的离心，使得质粒得不到富集，从而使得11号孔的电泳图成为空白。

但通过后面的酶切及蛋白电泳我们可以排除第一种可能。

从图中可以清晰地看见一条带，说明质粒在遗传过程中具有稳定性。

(3) 在进行的酶切电泳分析中第5孔没有出现任何的条带，应该是因为在离心时没有对保存的菌液进行摇动而出现差错，也有可能是因为菌种保藏的条件做得不好，使菌出现大量死亡，菌体不能得到富集。

6号和11号孔可以清晰地看见两条带（表达载体带和目的基因带），说明质粒具有稳定性，酶切电泳图效果不好是人为造成的，可能是因为上样孔不平齐，也可能是因为电流过高。

(4) 在蛋白电泳图中，没有对第5号和第10号也就是第20代和第45代的基因工程菌的进行诱导表达，是因为在进行酶切电泳分析时第5号孔及10孔的图谱不清晰，也就是对本试验第5和10号孔的质粒的稳定性提出了质疑。

蛋白电泳图中marker在聚丙烯酰氨凝胶中出现了5条带，而诱导表达的外源基因的蛋白在聚丙烯酰氨凝胶上的图谱与marker接近，且表达量最大的是介于marker最前端的两条带之间，也就是介于14.4kDa 到20.0kDa之间，而IL-2的分子量大约在15.0kDa，所以蛋白电泳图的结果表明目的蛋白得到一定量表达，从而说明携带外源基因的质粒的遗传稳定性。

(5) 本文构建的重组工程菌[pET32a-IL2 BL21（DE3）]经连续传代培养50代，在LB(–)和LB(+)培养基的生长形态特性无明显差异；目的基因的诱导表达结果表明不同传代次数的工程菌具有相似的表达能力；重组质粒经双酶切电泳鉴定表明基因结构稳定。

该重组工程菌具有良好的遗传稳定性，这可能与以下几个方面的因素有关：a、工程宿主菌Bl21对外源质粒有较好的兼容性；b、重组质粒本身结构稳定,不易发生缺失、插入或重排，从而保正构建目的基因的稳定性；c、外源基因IL-2与宿主菌相应基因具有较高的同源性，从而减少了目标基因诱导表达时宿主菌对其的排异性；d、重组表达质粒不是很大(约15kb)，这也有利于该质粒在宿主菌中的稳定共存。

-11-
3.2 质粒稳定性影响的若干因素
3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制
根据基因工程理论，重组质粒启动子如果为诱导型，则其活力受控于受体细胞的代谢。

因此，形成基因工程菌的阶段培养原则，即调控环境参数(碳氮比、pH、培养温度、溶氧等)。

发酵前期，保持受体细胞生长速率，提高受体细胞浓度，控制外源基因不大量表达，这能保证重组质粒稳定地遗传；培养后期，适当调控以提高质粒拷贝数，加强转录翻译效率，使外源基因高度表达。

3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性
为了提高含质粒细胞的竞争力，通常用选择性培养基进行培养。

首先在表达产物的质粒上引入抗生素抗性基因，再引入抗生素到培养基中，这对提高质粒稳定性非常有效，但对于大规模生产系统，抗生素的大量使用，不论从环境或成本都是不值得的。

3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响
不同培养操作方式对不同工程菌稳定性有不同的影响。

为了保持细胞生长良好的微环境，延长受体细胞生长对数期，多采用流加操作方式。

连续操作被认为是得到稳定性高的基因重组菌株的重要手段，而间歇操作在基因工程菌培养中较少应用。

培养工艺的建立必须先从理论上了解其受体细胞生长动力学规律以指导环境参数、操作参数的顺序变化，多次重复和改进，由此设计工艺操作的各项指标。

3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响
发酵的环境条件，如温度、溶氧水平、pH 值、N的供应、营养浓度控制等非常重要，对于一个已经组建完成的克隆菌株来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。

氧传递与搅拌对工程菌稳定性的影响：氧传递对固定化细胞或游离细胞培养影响很大，氧和营养供应受固定化胶粒屏障和胶粒表面高浓度细胞的限制，搅拌速率能影响细胞生长和产物合成，搅拌强度明显影响质粒丢失速率，游离和固定化细胞的质粒稳定性都随搅拌强度提高而下降，温和的搅拌速率适于保持质粒的稳定性。

另外发现，强烈搅拌使固定化质粒内细胞浓度明显减少，但细胞酶活力较高。

在搅拌罐发酵时，质粒拷贝数通常较摇瓶培养低，原因是搅拌罐中有较好通气，生长速率较高，因此染色体复制增加。

当溶解氧强度(DOT)在非选择性培养基中周期变化时，重组酵母连续培养质粒稳定性强烈依赖于培养的生长速率，在较低生长速率下完全稳定。

提高氧压力或增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，而过渡或稳定阶段缺氧条件引起氨基酸生产和质粒稳定性受限制。

温度和PH值对工程菌稳定性的影响：温度对基因工程菌培养影响很大，对含温敏启动子的质粒，必须用合适的温度诱导才能得到产物表达，而且必须选择适当的诱导时机，
-12-
因此，温度的控制更为重要。

与一般微生物发酵相似，重组工程菌的生长和产物合成时的pH值往往不同，如重组Lactococcus lactissubsp. Lactis(pIL252)对生长和质粒稳定性的最适pH值分别为6.39和6.41.
-13-
4结论
连续传代培养结果显示，工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似，这初步说明基因工程菌质粒的遗传稳定性。

再将不同代质粒进行电泳、酶切，发现电泳图平行、酶切片段的位置大致一致，这在一定程度上说明了质粒的遗传稳定性。

最后从蛋白分子量上进一步确认，诱导表达的外源基因的蛋白分子量介于14.4kDa到20.0kDa之间，而IL-2的分子量大约在15.0kDa，从而说明携带外源基因的质粒的遗传稳定性。

-14-
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[20] Chul H K,Jang Y L,Min G K,et al. Understanding Genetics. Oxford University
Press,1998,86(4):391～394.
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致谢
本文的顺利完成得益于每一位关心、爱护、支持和帮助我的老师、师兄和同学，在此表示深深的感谢，我将会把你们的教诲铭记在心，扎扎实实地学习和工作，用我的行动来感谢你们的帮助。

首先感谢我的导师双宝老师，双宝老师严谨求实的治学态度、高度认真的敬业精神，踏实的工作作风以及敏捷的思路，使我受益匪浅，我所获得的每一点成功都与老师的辛勤教诲是分不开的。

在此论文完成之际，学生对老师的无私教诲表示崇高的敬意和衷心的感谢。

论文的完成还得益于李明师兄的热情指导和大力帮助，正是在他的指导和帮助下，才使我能够顺利完成了论文的试验过程。

同时，他勤奋，踏实的求学精神，以及开朗乐观的生活态度使我能够充实，愉快的完成论文试验。

在此，谨向他表示衷心的感谢。

最后，在此即将离开之际，谨向东北农业大学成栋学院表达我深深的感激之情。

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