海洋药物筛选技术

海洋药物大规模筛选系统中的生物技术

摘要：随着医药水平的发展，人们对药物的需求越来越高，开发海洋药物资源已经是药物开发的一个趋势。其中海洋药物筛选是研究和开发海洋药物的重要一步。现代的药物筛选模式主要是建立在分子和细胞水平上的高通量筛选模式，主要有生物芯片技术和基因打靶技术等。生物芯片技术是将大量的生物大分子样品制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，然后与已标记的待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现对样品的检测。基因打靶技术包括能去除目的基因的基因敲除技术，以及将目的基因定点整合到基因组特定位点的基因导入技术，即对一些模式动物的染色体进行操作, 在其染色体中删除或导人疾病相关基因, 使动物表现相关疾病的症状, 使其更接近于临床疾病的表型, 因而更适合于新药的筛选工作。

关键词：海洋药物筛选生物芯片基因敲除基因导入

海洋药物是海洋生物资源中一种重要的资源。经历近半个世纪的探索和发展，海洋药物研究已经积累了许多丰富的研究资料，特别是近年来生物技术的迅猛发展，为海洋药物开发提供了新的研究方法、研究思路和发展方向。现代的化学研究方法与多种生物技术越来越紧密地结合，已成为当今海洋药物研究发展的主流，并成为今后数十年海洋药物研究的主要趋势。

筛选是研究和开发海洋生物活性物质的重要一步。传统的药物筛选模型有整体动物筛选模型和组织器官筛选模型，即以动物或动物组织器官作为药物筛选的观察对象，以动物或动物组织器官对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。这两种筛选方法准确率相对较高，但是对样品的要求量较多，工作量大，筛选效率较低，成本相对过高。近年来随着生物芯片技术以及转基因技术的快速发展，建立在分子和细胞水平上的高通量筛选技术已日趋成熟。该方法样品用量少，筛选费用低廉，结合计算机技术可提高工作效率，实现自动化大规模筛选。欧美一些发达国家已将该种筛选方法作为常规的新药筛选途径。[1]

1 生物芯片技术

1.1 生物芯片概述

生物芯片(biochip)是将大量的生物大分子，如核苷酸片段、多肽分子、组织切片和细胞等生物样品制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，构成二维分子阵列，然后与已标记的待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现对样品的检测，因此该技术一次能检测大量的目标分子，从而实现了快速、高效、大规模、高通量、高度并行性的技术要

求。因常用玻片/硅片等材料作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。根据芯片上的作用物不同，可分为基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片和芯片实验室等，其中芯片实验室是指将芯片反应的三个步骤都集中在芯片上了。[2]

1.2 生物芯片的制备方法（以基因芯片的制备为例）：

根据研究目的选用合适的寡核苷酸、cDNA片段或特定的功能基因，构建点阵列。然后将所需的核苷酸片段原位合成于芯片上，或以大致相当的浓度，按一定的排列方式点样在特定的固相支持物上[2]。芯片种类较多，制备方法也不尽相同，但基本上可分为两大类：一类是原位合成；一种是直接点样。原位合成适用于寡核苷酸；直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。

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1.2.1 原位光刻合成

寡聚核苷酸原位光刻合成技术采用的技术原理是在合成碱基单体的5 羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5 端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。

1.2.2 点样法

点样法是将合成好的探针、cNDA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置,多个打印/喷印针的打印/喷印头,一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。

1.2.3 电子芯片[4]

电子芯片是由美国Nanogen公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化，制成1mm×1mm 的阵列,每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片最大特点是杂交速度快，可大大缩短分析时间,但制备复杂、成本高是其不足。

1.2.4 三维芯片[5,6]

三维生物芯片实质上是一块显微镜载玻片，其上有10,000个微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶DNA、RNA和蛋白质的分析。先把已知化合物加在凝胶条上，再用3cm 长的微型玻璃毛细将待测样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到0．2nl的体积打到凝胶上。该法敏感性强，所需DNA 量少，以三维构像存在。

1.2.5 流过式芯片[7]

该种芯片的片基制成格栅状微通道，将特定的寡核苷酸探针结合于微通道内芯片的特定区域。对待测样品进行荧光标记，然后流过芯片，固定的寡核苷酸探针就会捕获与之相互补的核酸。流过式芯片敏感性高，检测速度快，成本低。

1.2.6 PNA芯片[8]

由于探针/靶核酸形成杂交体需要的缓冲液也可以使靶核酸参与非期望的杂交而变得复杂化。如：当dsDNA作为分析物时，靶与互补链会复性；ssDNA也会形成二级、三级结构，这些副作用导致探针分子无法接近靶核酸，导致杂交信号的减弱甚至丧失。解决这一问题的一个重要途径就是加入物理性质与靶核酸不同的探针。目前人们已开发利用DNA类似物PNA(pep—tide nucleic acid)，PNA 是一种以一N一(2一氨乙基)—甘氨酸为骨架的核酸衍生物，生理条件下，每掺入一个单体，杂合体的Tm会提高1.5℃；与DNA探针相比，PNA探针具有更高的亲和力及序列特异性。

1.3 待测样品的准备，杂交检测与数据分析

将从海洋生物细胞中提取的RNA后经反转录形成的cDNA、基因片段等，采用常规的基因分离，反转录，扩增标记等获得。为了得到杂交信号，在扩增过程中通常加入同位素或化学荧光素进行标记[9]。然后将标记物通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描来检测杂交信号的强弱和分布。将得到的扫描图像输入计算机，用专门的软件对杂交产生的印迹进行数据的自动化处理和定量分析，包括阳性点的确定，图像背景的识别和扣除，将所得的数据标准化后进行统计分析，得到基因的表达图谱。[9]

1.5 生物芯片用于药物筛选

生物芯片用来筛选药物是基于对一些重大疾病相关的发病机制的研究与认识, 通过对生物体发病期间机体组织中细胞因子类物质、细胞膜受体及其它成分变化的研究,克隆相关基因片段, 按一定的排列方式固定到芯片上, 用候选药物处理动物或细胞, 将会导致动物或细胞基因表达谱的变化, 掺人标记分子后, 与芯片上的探针杂交, 以此可以初步确定侯选药物针对某种疾病的药效学活性, 如果该芯片上偶联有多种疾病相关基因的话, 甚至可以在同一块芯片上检测到侯选药物的多种药效学活性[10]。如从芯片药物浓度梯度的表征实验[11]可知, 当通入浓度为100 μg/mL 的CTP-11（伊立替康）溶液, 芯片可形成6 个一定梯度的药物浓度作用芯片培养的肝癌细胞(0、21.2、52.3、66.8、76.9 和100 μg/mL), 细胞的活性分别为91.6%、84%、75.3%、66.1%、55.3%和37.4% 。因此不同浓度CTP-11 作用细胞后, 细胞生长活性受到不同程度的抑制, 抑制作用随药物浓度的升高而增强。通过对荧光照片的分析, 在不同药物浓度作用下, 可以发现凋亡过程中细胞的形态变化, 如细胞体积缩小、细胞突起以及凋亡小体。可见本实验的微流控芯片通过一定的梯度浓度药物刺激细胞, 分析