蜡样芽孢杆菌风险评估

蜡样芽胞杆菌的生物危害评估报告
一、细菌的传播与致病
蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。

已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。

在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。

1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。

蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。

蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。

引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。

中毒的发病率较高，一般为60-100%。

但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。

当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。

蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。

呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。

腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种
类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。

严重者还可导致败血症。

蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌可产生肠毒素。

它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。

致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。

致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。

二、细菌的生物学特性
蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。

根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。

蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，需氧或兼性需氧，生长6h即可形成原形芽胞，芽胞位于菌体的中心或次末端不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。

引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力无荚膜。

它的生长温度为25-37℃，最佳温度30-35℃。

在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。

在普通琼脂上
生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状故而得名。

偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。

在甘露醇、卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。

能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素等，VP实验阳性，可液化明胶，卵磷脂酶阳性，但多次传代后，其生化特性常可改变。

此外蜡杆芽胞杆菌耐热，其食物中毒菌株中的游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。

本菌对氯霉素、红霉素和庆大霉素敏感，对青霉素、磺胺类和呋喃类耐药。

三、细菌的实验室检查及其它检查
1.标本收集采集可疑食物或收集粪便和呕吐物进行直接涂片染色镜检和其他操作。

2.活菌计数无菌操作称取样品50g放入灭菌搅拌缸内。

加Butterfield磷酸盐缓冲稀释液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均质2min。

用上述1:10稀释液，连续稀释供蜡样芽胞杆菌计数。

移取10mL均质样液（1:10稀释）加到90mL空白液中，从10-2到10-6制备一系列稀释液，充分混匀，并继续稀释直到10-6为止。

取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL 接种2只MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。

将平板置30℃培养24小时，并检查菌落周围有沉淀圈者，表示产生卵磷脂酶。

蜡样芽胞杆菌菌落通常是粉红色，随着培养时间的延长则更明显。

如果上述反应不清晰，应将平板再培养24小时后计数，从MYP平板上挑取典型菌落5个或更多，移种到营养琼脂斜面上供蜡样芽胞杆菌证实试验用。

3.MPN技术被推荐用于食品中低于10个/g蜡样芽胞杆菌的检验。

某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。

在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中接种3管MPN系列，10-1、10-2、10-3的稀释液各接种1mL于3管。

将培养管置30℃培养48±2小时，检查生长密集、典型的蜡样芽胞杆菌。

将阳性管培养物划线接种于MYP平板，于30℃培养24-48小时。

以下步骤同2。

4.分离培养将可疑食物置无菌乳钵中，加适量生理盐水研磨后，划线接种于普通琼脂平板或血琼脂平板，若为呕吐物可直接划线接种于上述平板，于37℃培养，
5.若有类似蜡样芽胞杆菌的菌落出现再进一步分离纯化以及进行生化反应。

6.蜡样芽胞杆菌的证实试验蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件：1)革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出体外；2）在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；3）厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；4）还原硝酸盐；5）VP阳性；6）分介L-酪氨酸；7）在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。

7.蜡样芽胞杆菌群的鉴别试验要鉴别典型蜡样芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌群的其它种还需进一步进行下述试验：1）动力试验；2）根状生长试验；3）溶菌活性试验；4）蛋白质毒素结晶试验：蜡样芽胞杆菌有动力、强溶血、不形成根状菌落，或不产生蛋白质毒素结晶。

而且蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18%的条件下仍能存活或生长。

通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。

8.血清学分型、噬菌体分型。

四、细菌的防治
蜡样芽胞杆菌所引起的食物中毒多因食品在食用前保存温度较高（20℃以上）和放置时间较长，故对中毒的预防包括：由于蜡样芽胞杆菌在15℃以下不繁殖，剩饭、剩菜应放在低温保存。

该菌污染的食品一般无腐败变质的异味，不易被发觉。

因此，剩饭、剩菜在食用前一定要再加热。

注意食品的贮藏和个人卫生，防止尘土、昆虫及其他不洁物污染食品。

若一旦发生了中毒，则立即停止食用可疑污染的食品，多饮水。

一般不需要使用抗生素治疗。

腹泻较重者可到医院就诊。

五、细菌的生物安全防护
根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）蜡样芽胞杆菌属于三类，BSL-2。

（1）操作要求
1、实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。

2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。

食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。

3、所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。

4、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。

5、注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。

用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。

非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。

6、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。

盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。

7、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。

转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。

离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。

8、溅出或偶然事件中，明显暴露于传染源时，要立即向实验室主任报告。

进行适当的医学评估、观察、治疗，保留书面记录。

9、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。

污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。

（2）安全设备
1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。

2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。

3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。

4、当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（跟镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅或洒到面上。

5、在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。

人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。

防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。

6、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。

一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也不应当戴着到实验室外。

要备有带滑石粉的乳胶手套。

脱掉手套后，要洗手。