、细菌培养技术

（二）细菌培养技术
将已接种细菌的培养基置于37℃温箱中培养18-24小时， 即可观察到大部分细菌的生长现象。但标本中菌量很少或生长 速度缓慢的细菌如结核分枝杆菌则需培养1周甚至1个月才能观 察到其生长现象。
实训提示
1．细菌接种时必须严格执行无菌操作。 2．接种前应确定培养基无污染（如液体培养基应澄清、透 明）。 3．平板划线应注意接种环与培养基表面的角度（30-45°）， 运用腕力使接种环在培养基表面滑行；避免接种环划破培养基， 影响分离培养结果。 4．穿刺接种时，接种针应在培养基内直行，不要左右移动。 5．根据细菌对气体、温度等条件的需求，选择合适的培养方 法。
2）分区划线法：将平板培养基分成4（或5）个区域进行划 线。此法适用于含菌量较多的标本。用接种环沾取少许细菌 标本在平板培养基表面一角，以“Z”字形不重叠连续划线作 为第一区，其范围不超过平板的1/4；然后将接种环烧灼灭 菌，冷却后于第二区再作连续划线，在开始划线时与第一区 的划线相交数次；完成后将接种环烧灼灭菌，继续按上述方 法，分区划出第三、四区。
2．无菌操作技术
（1）在无菌室、超净工作台或接种罩内进行。 （2）无菌室、超净工作台、接种罩在使用前后需要用消毒 液擦拭，再用紫外线灯照射消毒。 （3）所有器具、培养基等均需严格灭菌，使用过程中不能 与外界未经消毒的物品接触，切忌长时间暴露在空气中。 （4）无菌试管、烧瓶等容器在开塞之后及塞回之前，口部 均须在火焰上通过2-3次，以杀死可能附着于管口、瓶口 的细菌或可能从空气中落入的杂菌。 （5）接种环（针）每次使用前后，均应在火焰上彻底烧灼 灭菌，金属棒部分亦须通过火焰灭菌。 （6）操作完毕，应消毒剂洗手，再用自来水冲洗。
六.实训结果
观察细菌在各种培养基中的生长现象： 1．琼脂平板：划线应疏密得当，经培养后则形成一定 数量、彼此分离的单个菌落，且菌落性状应符合该 细菌的特征；无或少出现污染菌落。划线原始区的 菌落密集、细小，成菌苔状生长，3、4划线区的菌 落呈单个分布，易于观察菌落特征。 2．液体培养基：应观察到均匀浑浊，或沉淀，或出现 菌膜或培养基颜色改变等现象，且符合该细菌的特 征。 3．斜面培养基：应形成纯化的菌落或菌苔，无污染菌 出现。 4．半固体培养基：有鞭毛的细菌经培养后，穿刺线应 模糊；无鞭毛的细菌经培养后，穿刺线应清晰。
三、实训材料与设备
1．试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。 2．器材：三角瓶、试管、量筒、吸管、电磁炉或电炉、手 提式高压灭菌锅、天平、报纸或牛皮纸、白线绳、pH试纸等。 4.分组：每组4人，共12组 内容 数量 所需体积 总体积 液体 4支试管 20ml 斜面 4支试管 20ml 半固体 4支试管 20ml 平板 8块平皿 160ml
实训四
一、实训目的
细菌培养技术
-细菌接种与培养技术
1.学习细菌接种与培养技术。 2．学会无菌操作技术，为细菌鉴定、控制等技能奠 定基础。
二、实训原理
纯种分离：将待分离的细菌标本进行适当的稀释，使 细菌细胞尽量呈分散状态，从而生长形成单个菌落。 再将单个菌落移种至合适的培养基中，经培养可得到 大量纯种细菌。
250ml
四、实训步骤
（一）细菌接种技术
1．常用接种工具的使用 （1）接种针：用镍铬合金或白金丝制成，长5-7cm， 一端固定在约20cm的铝制杆上，铝制杆的另一端套 有隔热绝缘柄。主要用于半固体培养基穿刺接种和 液体培养基接种。 （2）接种环：是镍铬合金或白金丝的前端弯曲成34mm密闭环状。主要用于固体平板和斜面划线接种， 以及液体培养基接种。
（3）斜面培养基接种法：用于细菌纯培养或菌种保存。方 法与液体接种法相似：左手握持斜面培养基时，应将其斜 面朝上。管口经火焰灭菌后，将已沾取菌种的接种环（或 接种针）伸进管内，先从斜面的底部轻轻划一直线至顶端， 然后再从底部划“Z”形线至顶端；或先从斜面正中垂直刺 入底部，再抽出在斜面划“Z”形线至顶端。
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（2）液体培养基接种法：右手持接种环（或接种针），烧灼 后冷却，左手握持菌种管和液体培养基管；以右手掌心与小指、 小指与无名指分别夹取棉塞，将试管口迅速通过火焰灭菌；用 已灭菌的接种环沾取菌种，迅速将菌种伸进倾斜的液体培养基 管内，在接近液面的管壁上轻轻研磨；取出接种环并在火焰中 烧灼灭菌，两试管口通过火焰灭菌后，将棉塞分别塞于原试管。 直立试管，菌种即混合于液体培养基中。
3．基本程序：灭菌接种环（针）→稍冷却，沾取细 菌标本→进行接种（启盖或塞、接种、加盖或塞） →接种环（针）灭菌。 （1）平板划线接种法：目的是将混有多种细菌的标 本，经划线分离使其单个分散生长形成单个菌落。
常用平板划线法：
1）连续划线法：适用于含菌量较少的细菌标本。用已烧 灼灭菌的接种环沾取适量标本，于平板培养基表面做“Z” 字形连续划线，逐渐向下延伸直至划完整个平板表面。
（4）穿刺接种法：适用于半固体培养基接种。方法： 用接种针取菌种，从培养基表面正中垂直刺入至接近 但不能达到管底，然后原路抽出。
（5）倾注平皿法：可用于饮用水、药物等检品的微生物数 量测定。方法：取经适当稀释的检品1ml置于无菌培养皿中， 再注入冷却至50℃左右的琼脂培养基15-20ml，混匀，静置 待其凝固后放培养箱内培养至规定时间，作菌落计数，即可 计算出检品中微生物的数量。
实训思考
1．无菌操作技术在微生物学实验中有何意义？ 接种细菌时应怎样做到无菌操作？ 2．为什么采用平板划线分离培养可以分离得到 纯种细菌？ 3．穿刺接种时，接种针为什么不能在培养基内 左右移动？ 4．如何区别平板上的目的菌落与污染菌落？