地高辛标记原理及步骤

地高辛标记及检测试剂盒I(POD)说明书

DIG Random Labeling and Detection KitⅠ（POD）(for color detection withDAB)DNA探针标记和检测试剂盒Ⅰ产品编号：MK1008保存期：一年-20℃冰冻保存。

用途：用于DNA探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。

工作量：可用于标记0.1—3μg的探针6次及1000张切片的原位杂交或12次10×10cm膜上杂交检测。

原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。

如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。

在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow 酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。

以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。

一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。

免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。

敏感性很高。

可用于膜上杂交和原位杂交。

试剂盒内容：1. DIG Random Labeling Mix(高效)，25μl2.Biotin—MouseAnti—Digoxin200μl3. SABC—POD200μl4. DAB Stock Solution5ml5. Blocking Reagent，5g特点：（1）标记属高效标记反应。

以1μg DNA探针为例，1小时反应即可产生0.8μg标记探针，20小时可产生2μg左右的标记探针。

（2）试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。

一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。

（3）标记反应适于下述对象：a.DNA从10ng—3μg。

b.不等的DNA长度100bp—10kb。

地高辛杂交方法

地高辛杂交方法：一、探针标记1.随机引物标记：模板定量：先用分光光度计测OD值，再用试剂盒中未标记的DNA（瓶2）作标准对照，递度稀释，跑电泳定量模板。

（10ngDNA量就可以在UV灯下看见）2.1ug-1.5ug左右的DNA模板（10ul）加重蒸水到15ul，沸水浴中煮10min，立即放置冰上，然后在模板中依次加入如下试剂：Hexanucleotide Mix, 10×(瓶5) 2uldNTP labeling Mix (瓶6) 2ulKlenow enzyme labeling grade(瓶7) 1ul3.混匀，在37℃标记16-18hr，用2ul 0.5M EDTA (PH＝8.0) 终止反应。

二、转膜除碱转以外的转法，如中性转，紫外交链。

三、杂交预杂交，42℃杂交炉中预杂交3-4hr，加入变性过的探针，杂交16hr以上。

2×SSC洗5min，5min，1×SSC洗，10min，（洗膜时在42℃摇床上洗，能洗净膜背面的杂质）。

四、免疫显色检测(所有操作时需要在摇床上摇动)1.洗膜后,在washing buffer中漂洗1-5min2.加100ml 新配制的1×封闭液洗30min, 速度不要太快,膜能飘动就可以3.加20ml Antibody solution(二抗),30min, 注意: 二抗稀释1:10000以上, 摇床速度不要太快,膜能飘动就可以,4.加100ml wanshing buffer, 分别洗5min,5min,10min,15min,摇床速度可以加快,5.加20ml Detection buffer洗2-5min,平衡PH作用,6.加10ml新配制的显色液, 滴加时多块膜放在不同容器中, 先在条带位置快速地从左到右滴加,以防止显色时间差异.7.当条带出现需要的结果时,用TE buffer 或者蒸馏水快速漂洗终止显色反应.8.将结果拍摄下来即可.附: 免疫显色需准备得试剂1.杂交前需配制的试剂(以下溶液均按1L算，灭菌)washing buffer: 0.1M 马来酸(Maleic acid), 0.15M NaCl, PH 7.5, 灭菌后加Tween 20终浓度为0.3℅(v/v).Maleic acid buffer: 0.1M马来酸(Maleic acid), 0.15M NaCl, 加NaOH 固体调PH 7.5, 灭菌Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, PH 9.5TE-buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,PH 8.02.显色时需配制的试剂10×封闭液:瓶10号的脱脂奶粉用马来酸溶解,浓度为10℅(w/v),65℃加热搅拌直至溶解,液体时不透明的，存在2-8℃，以备使用。

地高辛标记探针的Southern杂交

地高辛标记探针的Southern 杂交（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany）1. 探针标记步骤（20µl 体系）：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。

2)沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。

3)充分混匀DIG-high Primer （1#管），并取4 µl至变性DNA管，混匀并离心。

4)37 ℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。

5)停止反应，加2 µl 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热10分钟。

2. 探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。

操作步骤如下：1)根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量表2)将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟4)将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡2分钟5)将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟6)将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟7)用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟8)在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟9)将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。

地高辛标记核酸探针的标记方法

地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

地高辛作业指导书 (2)

1.分析原理
采用竞争法原理，整个过程18分钟完成。
第1步：10l标本与钌（Ru）标记的抗地高辛单克隆抗体混匀，形成夹心复合物，其数量取决于标本中分析物的浓度。
第2步：加入链霉亲和素包被的微粒和生物素标记的地高辛衍生物，后者与钌标记的单克隆抗体上未占据的位点结合，形成抗体-半抗原复合物。形成的完整复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。
4. Lindenbaum J, Mellow MH, et al. Variation in Biologic Availability ofDigoxin from Four Preparations. New Engl J Med 1971;285:1344-1347.
5. Lindenbaum J, Butler VP Jr., Murphy JE,CresswellRM.Correlation of Digoxin-Tablet Dissolution Rate with BiologicalAvailability. Lancet 1973;1:1215-1217.
12．参考文献
1. Hoffman BF, Bigger JT Jr. In: Gilman AG, Goodman LS, Gilman A,eds.The Pharmacological Basis of Therapeutics. 6th ed.NewYork,NY: MacMillan; 1980:729-760.
8.参考范围
通常地高辛的治疗浓度是0.9-2.0ng/ml(1.2-2.6nmol/l)。高于2.0ng/mL(2.6nmol/l)时一般考虑中毒。但中毒和非中毒剂量之间有交叉。因此,临床诊断应根据临床和实验室的数据综合考虑。各实验室应提供合适的报告形式以及一致的异常结果报告程序。如有必要，各实验室应自己测定一个参考值。

地高辛标记探针的Southern-杂交技术

地高辛标记探针的Southern 杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。

将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。

它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。

还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。

核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。

其基本过程包括以下几步。

首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印〞上去的，这个过程称为核酸印迹〔nucleic acid blotting〕转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法〔dot and slot blotting〕、菌落和嗜菌斑印迹法〔colony and plaque blotting〕；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。

最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。

根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术〔Dot blot〕、Southern杂交技术〔Southern blot〕、Northern杂交技术〔Northern blot〕。

前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。

本实验主要介绍Southern杂交技术。

1主要内容1. Southern Blot方法的原理。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳。

3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜与膜处理。

地高辛中文操作说明

所用试剂盒为Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，具体操作过程如下：①向一个反应管中加入1μg 模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μL；②沸水浴10min以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中；注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。

③充分混合DIG-High Prime(1号管)，并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心；④37℃孵育，过夜；⑤65℃加热10min，终止反应。

2）探针的纯化与回收用PCR产物快速回收试剂盒（上海生工）回收标记好的探针，同时除去随机引物和未掺入的DIG-dUTP。

具体操作步骤如下所示：①在PCR反应液中加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀；②8,000×g离心30秒。

倒掉收集管中液体；③加入500μl Wash Solution，9,000 ×g 离心30秒，倒掉收集管中液体；④重复步骤4一次；⑤空柱于9,000 ×g离心1分钟；⑥将吸附柱放入一个干净的 1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μl Elution Buffe r，室温静置1分钟后，离心1分钟。

保存管中DNA溶液。

⑦电泳检测探针的完整性，紫外分光光度法测定探针浓度，稀释到1 ng/μL 。

注：标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。

标记好的探针可以保存在-20℃。

3）检测探针标记的效率直接标记法：将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。

尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（2号管）作为标准。

具体操作步骤：（注意在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜）①分别从你标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1 μL点在尼龙膜上；②通过120℃烘烤30min的方法将核酸固定在膜上；③将膜转移到一个装有20mL 马来酸缓冲液的塑料容器中，在15-25℃中振荡孵育2min；④在10mL 封阻液中孵育30min；⑤在10mL 抗体溶液中孵育30min；⑥用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min；⑦在10mL检测缓冲液中平衡2-5min；⑧将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上（或者杂交袋），向膜上加入2mL的新鲜配制的的底物显色液，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。

地高辛标记dna探针原理

地高辛标记dna探针原理
地高辛标记DNA探针是一种通过标记染色体上的特定DNA序列用于鉴定、检测和定位目标DNA的技术。

其原理主要涉及两方面，一是DNA杂交，二是标记检测。

首先，标记DNA探针通过与目标DNA发生杂交反应，将DNA探针上的特定DNA序列与目标DNA上的互补序列结合，使探针与靶标DNA 形成双链DNA杂交物。

这种杂交反应通常在高温下进行，以便将DNA 双链分离，随后在低温下进行，以便使探针和目标DNA结合。

其次，标记检测通过将探针的DNA序列与荧光染料等标记物进行连接，以获得可见的信号。

在探针杂交反应后，如果探针成功与目标DNA结合，则标记物也会随之结合，反之则不会结合。

通常通过显微镜或荧光成像系统观察标记信号来确定目标DNA的存在。

因此，地高辛标记DNA探针的原理主要基于DNA杂交和标记检测技术，可以用于检测和定位目标DNA，为分子生物学等领域的研究提供了有力的支持。

地高辛标记系统

变性DNA管，混匀并离心。 37 ºC温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。停止反应，加2 µ l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ºC
加热10分钟。
地高辛标记系统
本次实验标记步骤(10µl)
将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 µ l。沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链
探针的标记
地高辛标记系统
地高辛标记系统
常用标记物分类
放射性同位素标记
非放射性标记荧光素标记生物素标记地高辛标记
地高辛标记系统
地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。
与放射性同位素标记方法不同之处
无害,安全产生的废物不需特殊处理需要分析的时间短探针稳定
地高辛标记系统
地高辛标记与检测的原理
利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端
探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探针
地高辛标记系统
Dig-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下标记产量
Template DNA 10 ng 30 ng 100 ng 300 ng 1000 ng 3000 ng
1h 45 ng 130 ng 270 ng 450 ng 850 ng 1350 ng
20 h 600 ng 1050 ng 1500 ng 2000 ng 2300 ng 2650 ng
120ºC固定30分钟或紫外交链3-5分钟将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室

地高辛标记核酸探针

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

地高辛标记的探针是一种非放射性探针。

1设计 Digoxigenin 标记探针的引物。

每种血清型在保守区域设计一对通用引物。

2 标记探针合成(引物来源上述）
（1）各血清型阳性质粒模板的扩增。

（2）利用引物，通过PCR《参照罗氏公司 PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书》，合成标记探针。

（3）电泳、回收、纯化和定量
3 核酸斑点杂交检测
（1）其他病毒核酸作对照，12种血清型PCR扩增产物。

（2）将12种探针和探针PM（混合探针）与同一血清型不同含量的核酸用常规方法进行核酸杂交。

4.显色。

地高辛标记原理及步骤

斑点杂交实验【实验原理】用的高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。

【实验步骤】1．处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。

（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）2．变性：将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。

（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上）【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。

3．点样：将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。

4．预杂交：将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。

用1000μL加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。

除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min。

【原理】封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。

5．杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。

（已准备好）6．杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL，除去气泡，封口。

置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。

7．洗膜：（1）回收杂交液；（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min；（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min。

【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。

8. 封闭：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min。

【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。

地高辛DNA标记试剂盒II

灵敏性: 在1µg已消化的人类胎盘DNA的
Southern Blot实验中，可检测到单拷贝的基因。
DNA探针标记方法
步骤
操作方法
在反应管（例如1.5ml微量离心管）
中加入10ng-3µg的模板DNA，然后
1 加入无核酸酶的水至15µl。对于对
照反应，加入 1µl 对照 DNA 和 14µl
产品说明书
注意：孵育过程中应避光，避免摇动，可短时观察显色进程。
7.用双蒸水或TE缓冲液洗涤5分钟终止反应，照相记录结果。
图示：
标记的探针量：
模板DNA量反应1小时
10 ng
15 ng
30 ng
30 ng
100 ng
60 ng
300 ng
Байду номын сангаас
120 ng
1000 ng
260 ng
3000 ng
530 ng
应。
二. 探针标记效率检测：取1µl标记产物，用DNA稀释液稀释后点
样于试剂盒提供的标准膜条上，用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按下述方法进行信号检测，然后与标准膜条上的信号强度对比，推算出标记的探针浓度。
深圳莱伯克生物科技有限公司
稀释方法：
试管号
标记的 DNA(µl)
DNA 稀释液(µl)
应用领域：地高辛标记的探针高度稳定，用途广泛。
可用于： z 非同位素的 Southern Blot z Northern Blot z 原位杂交（ISH） z 菌落杂交 z 斑点印迹杂交分析等。
质量控制: 用GAPDH对照DNA按照下述的操作
方法验证，在点杂交实验中，0.1 pg同源的 DNA在显色16小时后可检测到 (1 pg同源的 DNA，在显色1小时后可检测到)。

地高辛标记系统

随机引物标记
利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11dUTP，Klenow 酶及反应所需的Buffer
DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP 随机引物法标记的探针是基于模板的不同区段、不同长度的DNA 片段可以探测0.03-0.1pgDNA
备注：
含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 ºC 保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 ºC处理10分钟即可不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液
定量结果分析
染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA 染色情况计算出地高辛标记的DNA 的量。
如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想如果0.1pg的对照显色， 0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng探针/ml杂交液）如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针
地高辛标记与检测的原理
利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探针根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来

地高辛标记核酸探针的标记方法

地高辛标记核酸探针的标记方法地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3,末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书

地高辛标记与检测D N A试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜50张指导手册1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2.介绍2.1产品简介3.操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1 无标记对照DNA12 无标记对照DNA23 DNA稀释缓冲液2管1mL50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃澄清溶液4 DIG标记的对照DNA20μL5μg/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率5 六聚核苷酸混合物6 标记用混合物7 DNA聚合酶1大片段标记级8 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物200μL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9 NBT/BCIP10 封阻试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。

在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者10×SSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉）注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。

地高辛标记原理及步骤

地高辛标记原理及步骤地高辛（Digoxin）是一种植物来源的药物，常用于治疗心脏病和心律失常。

在临床实验室中，地高辛也可用于标记其他物质，以便进行研究和诊断。

本文将介绍地高辛标记的原理及步骤。

一、地高辛标记的原理地高辛标记是一种共价标记方法，通过将地高辛与待标记物质结合，使其能够被检测出来。

该方法基于地高辛的特殊结构和与其他物质之间的化学反应。

地高辛的结构包含一个呈环状的核苷苷酸结构，其中有一个活性位点。

这个活性位点可以与其他分子中的羟基或氨基等活性基团发生化学反应。

在地高辛标记中，我们利用这个活性位点将地高辛与待标记物质连接起来。

二、地高辛标记的步骤1. 准备地高辛标记试剂首先，我们需要准备地高辛标记的试剂，包括地高辛分子和反应条件。

根据不同的实验需要，地高辛可以选择单独标记或与其他分子共同标记。

2. 标记反应的进行将待标记物质与地高辛标记试剂加入反应体系中，控制好反应时间和温度。

反应条件的选择需要根据实验的具体要求来确定。

3. 纯化标记产物完成标记反应后，需要对反应产物进行纯化，以去除未反应的地高辛和其他杂质。

常见的纯化方法包括色谱层析、电泳等。

4. 检测标记效果对纯化后的标记产物进行检测，确定地高辛与待标记物质的结合情况。

常用的检测方法包括光谱分析、质谱分析、核磁共振等。

5. 应用标记产物纯化并验证了标记产物后，可以将其应用到相应的实验或诊断中。

根据实验的目的和需求，地高辛标记产物可以被用于免疫染色、荧光探针等多个领域。

总结：地高辛标记是一种常用的药物标记方法，其原理是通过地高辛与待标记物质的共价结合。

标记步骤包括准备试剂、标记反应、纯化产物、检测效果和应用标记产物。

掌握地高辛标记原理及步骤对于科研和临床实验室中的药物研究和诊断具有重要意义。

地高辛检测作业指导书

检验科免疫室分析项目作业指导书地高辛(DIGOXIN) 第页，共页版本：A/0生效日期：2008-02-0135批量常规标本的输入，在主菜单下选择Workplace- Testslection，在Sequence No栏输入起始标本号，然后选择该标本所需做的单个项目或组合项目，点REPEAT，输入该批标本的最后一个标本号，点OK即可。

进样分析，将标本按在Workplace菜单中输入的标本号顺序在样本架上排好，放入进样盘内,按START键，输入该批上机标本的起始标本号，再点START键，仪器自动开始推架检测标本。

5.质量控制用Elecsys DIGOXIN质控品1和2 （PreciControl Cardiac）。

质控品1和质控品2至少每24小时或每一次定标后测定一次。

质控间隔期应适用于各实验室的具体要求。

检测值应落在确定的范围内，如出现质控值落在范围以外，应采取校正措施。

6.计算方法对每一个标本，仪器会自动计算结果，换算方法是nmol/l⨯0.78=ng/ml或ng/ml⨯1.28=nmol/l7.参考范围通常地高辛的治疗浓度是0.9-2.0ng/ml(1.2-2.6nmol/l)。

高于2.0ng/mL(2.6nmol/l)时一般考虑中毒。

但中毒和非中毒剂量之间有交叉。

因此,临床诊断应根据临床和实验室的数据综合考虑。

各实验室应提供合适的报告形式以及一致的异常结果报告程序。

如有必要，各实验室应自己测定一个参考值。

8.分析性能9.干扰因素该方法不受黄疸（胆红素<65mg/dl）、溶血（血红蛋白<1g/dl）、脂血（脂质<1500mg/dl）和生物素<100ng/ml干扰，接受高剂量生物素（>5mg/天）治疗的病人，至少要等最后一次摄入生物素8小时后才能采血。

不受类风湿因子干扰（1630IU/ml）。

69种常用药物经试验对本测定无干扰作用。

在肾功能,肝功能衰竭病人和怀孕7-10个月的妇女血清中存在地高辛样的免疫反应物质(DLIS)。

地高辛显色原理

地高辛显色原理嗨，朋友们！今天咱们来聊聊一个特别有趣的事儿——地高辛显色原理。

这可不是什么枯燥的学术话题哦，就像一场奇妙的魔法揭秘。

我有个朋友叫小李，他在实验室里捣鼓这个地高辛显色的实验。

我就好奇地问他：“这地高辛显色到底是怎么一回事啊？感觉像神秘的魔法呢！”小李就笑了笑说：“嘿，这可比魔法还神奇呢！”那咱们就先来了解下地高辛是个啥。

地高辛啊，它是一种强心苷类药物，在医学上可有着重要的作用。

不过在实验室里，它又成了一种特别的标记物。

就好比它是一个带着特殊标记的小信使，在一些生物检测里跑来跑去。

地高辛显色的原理，这可就有点像寻宝游戏里的宝藏线索。

首先呢，有专门针对地高辛的抗体。

这些抗体就像是一群超级侦探，专门寻找地高辛这个目标。

一旦发现了地高辛，就紧紧地结合上去。

这就像钥匙和锁一样，严丝合缝。

我当时就想啊，这得多精准啊。

小李告诉我：“那可不，这就像是狙击手瞄准目标一样，错一点都不行。

”然后呢，这个和地高辛结合的抗体可不是单独行动的。

它还带着一个‘小伙伴’，这个小伙伴就是显色基团。

这显色基团啊，就像是隐藏在幕后的魔法师。

平常呢，它不显示自己的颜色，就安安静静地跟着抗体。

一旦抗体找到了地高辛，这个显色基团就开始发挥它的魔法了。

那它怎么发挥魔法呢？这就涉及到化学反应啦。

这显色基团在特定的条件下，就像是被点燃的烟花一样，开始展现出自己的颜色。

比如说，如果是用一种特定的底物，这个显色基团就会和底物发生反应，然后‘哗’的一下，颜色就出来了。

我就特别惊讶地说：“哇，这就像是灰姑娘穿上水晶鞋的瞬间啊，一下子就变了个样！”小李也笑着点头说：“哈哈，你这个比喻还挺形象呢。

”咱们再往深里想，为什么这个显色反应这么重要呢？就好比在一个巨大的迷宫里找东西。

地高辛可能是那个小小的宝藏，而显色反应就是那盏照亮宝藏的灯。

在很多生物实验里，我们要知道地高辛在样本里的位置或者含量。

如果没有这个显色反应，那就像在黑暗里摸瞎，啥都找不到。

罗氏地高辛说明书

DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜50张指导手册1 前言1.1 内容表1 前言1.1 内容表1.2 试剂盒成分2.介绍2.1 产品简介3. 操作步骤和所需材料3.1 在你开始前3.2 流程图3.3 地高辛标记DNA3.4 标记效率的确定3.5 DNA的转移和固定3.6 杂交3.7 免疫检测3.8 DNA印记的洗脱和再杂交除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。

在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

2.介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者DNA超螺旋的DNA实验时间检测数量一个试剂盒足够用于:25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg；并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。

质量控制根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA点在膜上16h后成色显影检测。

试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。

在干冰中运输。

一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。

采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。

3．实验步骤和所需材料3.1 在你开始前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：3.3 地高辛标记DNA介绍随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5×浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。

原位杂交-经典方法-地高辛标记探针

原位杂交(In situ hybridization)一、目的掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。

二、原理原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。

其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

三、仪器设备烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。

四、材料和试剂1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。

2．试剂：Davidson’s AFA固定液:330 ml 95％乙醇220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液）115 ml 冰醋酸335 ml H2O混匀后封口，室温放置；DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）；TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTAddH2O 900 ml （定容至1L）用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；0.4% 甲醛：37～39％% 甲醛 5.4 mlddH2O 495 ml；蛋白酶K溶液(Pr.K，10 mg/ml)：10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）；20×SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl0.3 mol/L柠檬酸钠88.23 g 柠檬酸钠ddH2O 900 ml （定容至1L）调pH至7.0，高压灭菌，4℃保存；2×SSC：20×SSC 100 mlddH2O 900 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；20×Denhardt’s溶液：0.4％牛清血蛋白0.4 g牛清血蛋白0.4％聚蔗糖0.4 g聚蔗糖0.4％聚乙烯吡咯烷酮0.4 g聚乙烯吡咯烷酮ddH2O 100 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20℃保存；杂交液：4×SSC50% 甲酰胺1×Denhardt’s5% 硫酸葡聚糖0.5 mg/ml鲑精DNA4℃保存；BufferI：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl用HCl调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌，4℃保存，；BufferII：0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agentBufferI 100 ml低温加热溶解，4℃保存一星期；BufferIII：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H2OddH2O 990 ml（定容至1L）用HCl调pH至9.5，0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；BufferIV：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA；显色液（NBT/BCIP使用液）：20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。