肾缺血再灌注损伤中细胞凋亡和氧化应激

HU Hong-lin1, WANG Gong-xian2 (1.Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang,
Jangxi 330006, P.R.China; 2.Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330006, P.R.China)
将置于 －８０℃冰箱保存的肾脏取出，裂解后制 作成细胞裂解液，考马斯亮兰法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法）行蛋 白定量，每个样本取含 ２００μｇ 总蛋白的细胞裂解 液，采用常规 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 法检测 ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓ－ ｐａｓｅ－８、ｂｃｌ－２ 和 ｂａｘ 蛋白的表达，应用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 冷光影像分析仪（ＬＡＳ－３０００，日本 Ｆｕｊｉｆｉｌｍ 公司）显 像，以 Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｍｕｌｔｉ－Ｇａｕｇｅ 软体定量分析蛋白条 带，并使用 β－ 肌动蛋白（β－ａｃｔｉｎ）作为内参照。所 用抗体均购自美国 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ 公司。 １．７ 肾脏抗氧化酶活性和总抗氧化能力检测
１ 材料与方法
１．１ 实验动物 清 洁 级 雄 性 ＢＡＬＢ／ｃ 小 鼠 ，６ ～８ 周 龄 ， 体 重
２０～２５ ｇ，均由巴黎第五大学医学院附属 ＣＯＣＨＩＮ 医院免疫实验室提供，微型动脉夹由法国 Ｍｏｒｉａ 公 司生产。 １．２ 肾 ＩＲＩ 模型
小鼠术前 ８～１２ ｈ 禁食，应用三溴乙醇溶液 （２００ ｍｇ／ｋｇ）腹腔内注射麻醉。肾缺血组：沿腹正中 线做 １．５～２．０ ｃｍ 的切口，逐层分离皮肤、腹膜，进入 腹腔，将肠道推向一侧，找到肾蒂后用无损伤微型动 脉夹迅速阻断左、右肾蒂，可见肾脏由鲜红变紫黑 色，表示夹闭成功。双侧肾蒂阻断 ４５ ｍｉｎ 后，去除动 脉夹，恢复血流灌注，可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜 红，恢复原来颜色，术毕分层缝合关闭腹腔。术后小 鼠于 ２４℃～２９℃的环境保暖，补充水与饲料。术中 应用生理盐水使小鼠保持充分的水化。对照组 （假 手术组）：同法打开腹腔并找到肾蒂，但不夹闭肾蒂。 １．３ 血清生化指标检测和收集肾脏标本
１．５ ＴＵＮＥＬ 法检测肾细胞凋亡 上述石蜡包埋后的肾脏制作 ４～６μｍ 切片，采
用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法 （ＴＵＮＥＬ 法） 检测缺血组和对照组肾细胞的凋亡情 况，具体步骤按 ＴＵＮＥＬ 检测试剂盒说明书操作（美 国 Ｒ＆Ｄ 公司，产品目录 ＃ＴＡ４６２７）。在荧光显微镜下 连 续 观 察 每 张 切 片．６ 免疫印迹法检测肾脏中凋亡相关蛋白表达
Abstract:【Objective】To explore the role of apoptosis and oxidative stress during renal ischemia -reperfusion injury（IRI）in BALB/c mice【. Methods】Renal arteries of mice were bilaterally clamped with micro-artery clamps for 45min to make model of renal IRI. The animals were sacrificed at 24 h post-operatively. Renal function (serum cre－ atinine and blood urea nitrogen) and pathology of the kidneys were examined. The expression of caspase-8, caspase3, bcl-2 and bax was determined by western blotting. The apoptosis of renal cells was measured by TUNEL. Renal total antioxidant capacity (TAC) as well as superoxide dismutase(SOD), glutathione reductase(GSH), catalase (CAT) were determined.【Results】Compared with control group at 24 h after operation, levels of serum creatinine and blood urea nitrogen were remarkably increased in IRI group (P <0.01), typical acute tubular necrosis with severe in－ flammatory cells infiltration were found in corticomedullary junction area under microscope, histological score for tubular damage in IRI group was much higher than that of control group (P <0.01). The expression of cleaved cas－ pase-8 P20, caspase-3 P11 and bax was upregulated significantly and the expression of bcl-2 was downregulated in IRI group compared with control group at 24 h after operation (P <0.05). The TUNEL-positive cells were increased significantly in IRI group. Renal TAC activity was reduced in IRI group (P <0.01). There was no difference in the level of renal SOD, GSH, CAT between IRI group and control group (P >0.05).【Conclusion】The apoptosis of renal cells is increased and renal total antioxidant capacity is decreased during renal IRI. Apoptosis and oxidative stress play important roles during renal IRI.
肾 脏 灌 注 后 ２４ ｈ， 经 眼 眶 内 眦 静 脉 丛 取 血 ０．３￣０．５ ｍＬ，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ、１０ ｍｉｎ 离心后吸取血清，检 测血清肌酐（Ｃｒ）和尿素氮（ＢＵＮ）。采血后引颈法处 死小鼠，取出肾脏。其中 １ 个肾脏置于 １０％中性甲 醛溶液中固定做病理组织学检测，另 １ 个肾脏用液 氮迅速冷冻，置于 －８０℃冰箱保存以备后续相关检 测。 １．４ 肾脏病理组织学检测
ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－３ 蛋白剪切片段和 ｂａｘ 蛋白的表达升高，ｂｃｌ－２ 蛋白表达降低。ＴＵＮＥＬ 法显示，肾小管细胞
凋亡明显增加。病理形态学显示，肾小管细胞出现片状坏死。肾脏病理组织学评分明显升高，肾组织 ＴＡＣ 降
低，差异均有显著性（Ｐ ＜０．０５），而 ＳＯＤ、ＧＳＨ 及 ＣＡＴ 等抗氧化酶的变化无显著性（Ｐ ＞０．０５）。结论 ＩＲＩ 肾脏
ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－３、ｂｃｌ－２ 和 ｂａｘ 蛋白的表达情况，ＴＵＮＥＬ 法分析肾小管凋亡情况，并作肾组织病理形态学检
查。定量分析灌注后 ２４ ｈ 肾组织中总抗氧化能力（ＴＡＣ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、谷胱甘肽还原酶 （ＧＳＨ）、
过氧化氢酶（ＣＡＴ）等抗氧化酶的变化。结果 ＩＲＩ 致肾功能明显损害，与对照组相比，缺血组肾组织中激活的
将置于 －８０℃冰箱保存的肾脏取出裂解后制作 成蛋白悬液，考马斯亮兰法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法）行蛋白定 量。采用化学比色法检测肾脏中超氧化物歧化酶 （ＳＯＤ）、谷胱甘肽还原酶（ＧＳＨ）及过氧化氢酶（ＣＡＴ） 的变化，采用终点比色法检测肾脏中总抗氧化能力 （ＴＡＣ）。试剂盒均购自美国 Ｓｉｇｍａ 公司。 １．８ 统计学处理
Key words: renal ischemia-reperfusion injury; apoptosis; oxidative stress; animal model
收稿日期：２０１０－０２－１４ ［通信作者］ 王共先，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｇｘ－ｍｒ＠１２６．ｃｏｍ，Ｔｅｌ：０７９１－８６９２５８１
第 ２０ 卷第 １５ 期 ２０１０ 年 ８ 月
中国现代医学杂志 China Journal of Modern Medicine
Vol. 20 No.15 Aug. 2010
文章编号： １００５－８９８２（２０１０）１５－２２７９－０５
·论著·
肾缺血再灌注损伤中细胞凋亡和氧化应激
胡红林 １，王共先 ２
中肾小管细胞凋亡增加，总抗氧化能力降低，肾小管细胞凋亡和氧化应激是肾 ＩＲＩ 的重要机制。
关键词：肾缺血再灌注损伤；细胞凋亡；氧化应激；动物模型
中图分类号：Ｒ６９２．５
文献标识码：Ａ
Apoptosis and oxidative stress during renal ischemiareperfusion injury in BALB/c mice
·2279·
中国现代医学杂志
第 ２０ 卷
凋 亡 和 氧 化 应 激 在 器 官 缺 血 再 灌 注 损 伤（ｉｓ－ ｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＩＲＩ）的发生、发展中起着 重要的作用。本研究对 ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠肾 ＩＲＩ 时肾细胞 凋亡情况与肾组织抗氧化活性的变化进行实验研 究，以探讨肾 ＩＲＩ 的发生机制。