第十六章 植物转基因技术

我国已商品化的转基因植物
名称 性能 单位 年份
转基因抗虫 棉
转基因蕃茄 转基因矮牵 牛 转基因甜椒 转基因蕃茄
对鳞翅目害虫抗性达80%
Monsanto,中国 农科院
华中农大 北大 北大 北大
1996
常温下可贮藏60—80天 观赏 抗黄瓜叶病毒 抗黄瓜叶病毒
1996 1996 1997 1997
4 从1986年到2002年全球主要国家审批了大量的转基因植物，
2、叶圆盘法： 采用打孔器对叶片进行打孔，得到圆叶片，致 使叶片四周都有伤口，与对数生长期的一定浓度的 农杆菌浸泡一定时间（数秒-数分），取出叶圆片， 用滤纸吸干，臵于无选择剂培养基上，共培养2-3天，
无菌水冲洗或直接于选择培养基上培养。对双子叶
植物较适合。
(1)叶盘法
双子叶植物较为常用、简单有效的方法。
的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体
因此需要连续的再生系统
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直
接分化出不定芽形成再生植株。
优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃 薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。
由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。 与对照相比减少农药用量80％，并减少用工150个/hm2，以上两 者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。
第二节 转基因在作物品种改良中的应用
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生 受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一 致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化 系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
4.胚状体再生系统
是指具有胚胎性质的个体。
优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。
最多的是美国，涉及生物种类106个，批准释放7436项，已
商品化的53项；加拿大释放5381项，已商品化47项；整个欧 盟涉及生物种类67个，释放1668项，已商品化18个；中国涉
及生物种类13个，环境释放103项，商品化59项，商品化程
度与发展最快的国家美国相似，但产业化速度尚需提高。
我国转基因作物研究与利用概况
Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合
的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D, 约有200kb组成。
根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分 成四种类型： 章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型（agropine） 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)
农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽
叶盘转化法
生根
3、活体接种法：
是一种简单易行的方法，转基因的受体为生长健康，无 病虫害的个体，选择生长旺盛、细胞分裂快的组织为接种部 位，将一定量的对数生长期的农杆菌用针头注射或用锋利刀 片切割后涂抹受体的敏感组织，转化组织可以保留在原个体 上，也可以切下来离体培养，以获得较高的转化效率。
体细胞杂交技术：是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组， 所转移的是大量基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后 代的表现型预见性较差。
转基因技术：转移的基因不受生物体间亲缘关系的限制，所操作和转 移的基因是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现型可准确预期。 一般不影响原有优良性状的表达。
与农杆菌介导的载体法相比较，DNA直接导入法虽然转化 效率不高，但大多不受受体植物限制，尤其基因枪的应用为 有经济价值的禾谷类作物遗传转化带来了生机，它是继农杆 菌介导转化法之后又一广泛应用的遗传转化技术。
二、农杆菌介导法
（一）农杆菌
农杆菌包括根癌农杆菌（Ti质粒）和发根农杆菌（Ri质
粒），质粒中含有一段可移动的DNA称为T-DNA，可作为外 源DNA的载体。
1、抗虫 2、抗病毒 3、抗病 4、抗非生物胁迫 5、抗除草剂 6、改良作物品种 7、改变花的颜色和形状 8、转基因植株作为生物反应器
第三节 植物转基因的方法
植物转基因技术包括：
目的基因的克隆
外源基因的导入
转基因植物的再生
转化：将外源的遗传物质导入生物体。
分离基因
克隆到某中间载体
pKS,pBR332,pGEM-T
一、研究进展
1 自1983年植物转基因首次在烟草上获得成功以来，标志着人类用转基 因技术改良农作物的开始。
植物遗传转化发展也异常迅猛。在短短十几年里，已经有35个科的 120多种植物转基因获得成功。 2 在全球45个国家中已经完成和正在进行的转基因作物的田间试验已超 过25000例，这些试验涉及60种作物10类经济性状的改造。
Ti Plasmid
T-DNA region
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留
auxin
Left border Right border
在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被 加工、剪切、复制， 然后转入植物细胞。
vir genes
ori
Ti质粒的功能区域
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）：
（四）农杆菌转化的方法
1、共培养法：
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤 组织共培养。
共 培 养 法
The co-integration method
应用共培养法应注意的问题：
（1）当受体为原生质体和悬浮细胞或愈伤组织时，仅适合用于对农杆菌
敏感的双子叶植物； （2）应用共培养法可获得较高的转化率，但仅局限于原生质体植板率较
高的材料，如烟草，而许多植物的原生质体经细菌感染后活力下降，
分裂停止。所以，采用细胞团和愈伤组织进行共培养，但易产生嵌合 体，需反复筛选； （3）用一定浓度的酚类化合物预处理农杆菌可提高转化率； （4）细菌与植物材料的保温时间是影响转化频率的重要因素之一； （5）在选择培养基上得到的转化体需分开培养，单独编号，作为一个单 独的转化体。
水稻农杆菌介导遗传转化过程 （Breitler等，1997）
三、基因枪法
**最早的基因枪（火药式）由美国康乃尔大学Sanford等 1987年设计制造 。
第十六章 植物转基因技术
第一节 转基因植物研究进展
植物转基因技术： 基因重组技术，DNA重组，即将人工分离和修饰 的基因导入植物基因组中，由于导入基因的表达而引 起植物性状的可遗传的修饰。
传统育种技术：通过母本之间的有性杂交实现基因转移的。这一过程 不但周期较长，而且还常常受到亲本材料的限制，一般只是在同种生物 个体间或亲缘关系非常近的个体间实现基因转移。
活 体 接 种 法
（五）农杆菌转化法的特点
1、受体类型广泛，可以是原生质、单细胞、细胞团、组织、
器官和植株水平；
2、简单易行、周期短、转化效率较高
3、转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以筛选、
淘汰未转化细胞； 4、影响转化效率的因素相对较少，受体再生系统、细菌株 系是其中的两个重要因素。
转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切/连接 克隆到植物表达载体
JM109, TOP10…
HindIII/EcroI… T4 ligase pBI121, pCAM1001…
转化农杆菌
LBA4404, EHA
基因枪转化
一、植物遗传转化的方法通常分为两大类： 载体法和非载体法。
1 载体法是以农杆菌（Agrobacterium)Ti质粒和Ri质粒为介导的遗 传转化方法，主要适用于双子叶植物和少数单子叶植物的转化。 2 非载体法即通过各种物理、化学等手段将DNA直接导入受体细胞进 行遗传转化的方法。归纳起来主要有以下几种：PEG法，电激法，基因枪 法，脂质体法，显微注射法，激光微束法，超声波法，炭化硅纤维法， 电离子透入法，以及花粉管通道法等。
1、农杆菌对植物细胞表面特定部位的识别和附着； 2、经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒上控制T区的基因
转移的Vir区基因活化并表达；
3、T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细菌和植物细胞的 壁，转移并整合到植物细胞的核基因组中。
近年来研究表明，“乙酰丁香酮”等酚类化合物可以活化Vir区基因， 提高转化效率。
7 <1 100
117
63 <1.5 789
15
8 <1 100
转基因作物种类 主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。
80% 60% 40% 20% 0% 大豆 玉米 棉花 其它 1999 2000
The worlds most important crops
世界银行下属机构预测，世界范围内转基因作物产业的交易 额： 2005年达到60亿美元； 2010年达到200亿美元， 1500万农民种植转基因作物
农杆菌: used extensively
for genetic enginr
inducing plasmid (bacterial plasmid)
T-DNA: (TransferredDNA), 可以转移进入植物基 因组.
Tumor induced by A. tumefaciens
主要涉及四大类基因，种植面积及所占比例归纳如下（表B）
表B 全球商品化转基因植物的基因类型（面积：百万亩）
被转化的基 因类型 抗除草剂
2000年 面积
490.5
所占比例 （%）