杂交瘤细胞冻存时间长短对其复苏后成活率的影响

摘要

杂交瘤细胞通常是由小鼠骨髓瘤细胞与脾脏细胞融合产生的。杂交瘤细胞分泌产生的单克隆抗体具有诸多优点，这也使得其在医学上应用广泛。产生单克隆抗体的融合细胞可以在液氮中冻存，达到随取随用的效果，但融合细胞的冻存时间长短可能会对复苏后细胞的成活率有很大的影响。本实验旨在测定不同冻存时间杂交瘤细胞复苏后的成活率，从而保证在杂交瘤细胞复苏成活率较高的时间期限内将细胞及时的取用，防止杂交瘤细胞由于冻存时间太长而失效。

关键词

杂交瘤细胞、单克隆抗体、抗体筛选、原代培养、传代培养、冻存时间、复苏、成活率、细胞计数

实验目的

1.熟悉细胞融合的步骤以及产生单克隆抗体骨髓瘤细胞的筛选；

2.掌握对骨髓瘤细胞进行原代及传代培养的方法；

3.熟悉细胞冻存与复苏的实验操作；

4.熟练掌握细胞成活率测定的方法。

实验原理

A.杂交瘤细胞的制备

杂交瘤技术即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。Kohler和Milstein证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的

能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。

杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B 淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。

B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。

脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

B.杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。

C.细胞的原代培养与传代培养

细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

D.细胞的冻存与复苏

为了保持培养细胞的生物学特性和活力，防止其发生遗传性质的改变，减少工作量和物资的消耗，在细胞传代培养时需进行细胞冻存和复苏。

细胞低温冻存的机制目前尚不十分清楚。细胞冻存时，如不加保护剂，其内部的水将直接形成冰晶，造成细胞内部膜结构的破坏，使其很难成活。应在冻存液中加入保护剂二甲亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）再进行细胞的冻存，保护剂可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内的水分在冻结前析出细胞外，并降低电解质浓度，使低温下增加的电解质浓度所造成的损害减少到细胞能够耐受的程度。

低温对细胞的损伤取决于降温和复温的速度和条件。为了保持细胞最大的成活率，一般采用慢冻快融的方法。缓慢降温可使细胞外液先冻结出现冰晶，细胞发生脱水，细胞内不出现冰晶。在细胞从0℃降温到-25℃这一阶段，冷冻的速度在（-1～-2℃/min ）为宜。当温度降至-25℃，降温速度可增至（-5～-10℃/min ），到-100℃可迅速浸入液氮中。

细胞的化学和物理活性在-130℃以下最小，所以要长期保存培养的细胞，目前最广泛应用的冷冻剂是液氮。液氮的沸点是-196℃，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，对细胞的pH值没有影响，气化时不残留沉淀。冻存的细胞在复苏时必须尽快融化，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5～0℃，以防止冰晶的损伤。