FVIII抗体检测

FVIII抗体检测

二、实验室诊断

（一）初筛试验

凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）正常，活化部分凝血活酶时间（APTT）延长。

（二）纠正试验（证实有时间依赖性的抑制物存在）

延长的APTT不能被正常混合血浆纠正。多数血友病患者替代治疗后产生抑制物显示特征性模式，即患者血浆与正常混合血浆按1:1比例混合后的即刻APTT 结果介于两种分别检测的APTT结果之间，但当37℃混合温育1-2小时后检测APTT，其APTT结果进一步延长。

（三）确诊试验

FⅧ:C减少，且随孵育时间呈进行性下降。

（四）抑制物定量测定（Bethesda方法；Nijmegen改良法）

1. Bethesda法（1975年，Kasper）

（1）试验原理：血友病A患者产生的FⅧ抑制物呈时间依赖性。在含抑制物的血浆中加入人源或猪源FⅧ，37℃混合温育，随孵育时间延长，FⅧ被抑制物逐渐中和。如加入FⅧ的量和孵育时间标准化，则可根据FⅧ被中和的量，以Bethesda 单位的方式确定抑制物滴度。

（2）检测方法：将患者血浆与正常混合血浆按一定比例混合，37℃温育2小时后，测定该混合物中剩余的FⅧ :C水平。1BU的定义：能使血浆中FⅧ:C 降低50%的抑制物活性为1个Bethesda单位（BU）。患者血浆稀释倍数的倒数为患者血浆抗体滴度的BU值。（图1）

图1. 抑制物检测（Bethesda法）

（3）操作步骤

1）将患者血浆用OVB缓冲液按一定比例倍比稀释，一般做多个稀释倍数，样本一直置于冰上保存。如果之前有关于抑制物检测的相关资料，则可作为参照对样本进行适当的稀释。

2）将正常混合血浆（FⅧ浓度已经过标准化检测）等量加入每份待测的稀释血浆样本中，FⅧ浓度通常为100 IU/dl。因此，每份混合物的FⅧ起始浓度大约为50 IU/dl。

3）37℃孵育2小时后进行FⅧ:C检测，采用正常混合血浆和乏FⅧ血浆的混合物作为标准品进行定标，并以该标准曲线来计算其它混合物的FⅧ活性。本检测中，此混合物的FⅧ:C为100%。

4）根据残余FⅧ与抑制物单位的关系图计算抑制物的浓度。

（4）结果解释：Bethesda试验结果解释见表1。

表1. Bethesda试验的结果解释

滴度（BU/ml）结果解释

＜0.5 不显著

0.5~5 存在低浓度抑制物：

——可以被过量的FⅧ纠正

——可能是低反应型

＞5 存在高浓度抑制物：

——FⅧ不起作用

——免疫记忆反应，产生更多抑制物（高反应型）

2. Nijmegen改良法（NA）

（1）试验原理：在正常混合血浆中加入0.1mol/L、pH7.4咪唑缓冲液。由于使用了缓冲体系，使反应中pH值更加稳定，提高试验准确性与敏感性，适合低滴度抗体的检测，受到世界血友病联盟（World Federation of Hemophilia，WFH）的推荐。

（2）试验方法：将患者血浆与缓冲后的正常混合血浆于37℃共同温育2小时，以保证体系pH稳定。以正常混合血浆与乏FⅧ血浆组成的对照混合物（和患者血浆混合物在同样条件下温育）为标准品制备标准曲线，其余样本按照该标准曲线检测残余FⅧ水平。采用假定100%残余FⅧ= 0BU/ml，50%残余FⅧ= 1BU/ml （国际上认可的抑制物活性转换方式）而建立的残余FⅧ和抑制物之间的相互转换的双对数曲线，将残余FⅧ转换为抑制物单位。当残余FⅧ活性＜25%，必须稀释后重新检测患者血浆，以免低估抑制物的滴度。规定抑制物滴度≥0.6BU/ml 为阳性（具有显著性临床意义）。

（3）操作步骤：使用咪唑缓冲液作为稀释液，将患者血浆进行倍比稀释，建议从原倍开始，1/2、 1/4、以此类推，每管总体积为0.2 ml。如果患者之前接受过抑制物检测，其检测结果可作为稀释度的大致指南。如果患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。其余步骤同Bethasda方法。

（4）结果解释：应选择残余FⅧ含量接近50%的稀释度，但也可选择残余F Ⅷ在30%~60%范围内的待测血浆稀释倍数用于抑制物的计算，只需计算每份稀释度的结果，取平均值即可。根据抑制物单位的定义，以残余FⅧ%-抑制物单位在双对数曲线上绘制标准曲线。

读取每份待测混合样本中残余FⅧ相对的抑制物水平，并以稀释倍数进行校正。例如：

（1/4 稀释 + 正常混合血浆）残余FⅧ= 50%，抑制物单位（根据图表）= 1 BU，乘以稀释倍数（4倍稀释）= 4BU

抑制物的诊断通常要以至少2次抑制物滴度阳性为准，包括患者过去对治疗

的反应及平时的药代动力学（pharmacokinetics，PK）研究。

（五）抑制物的分类（高滴度；低滴度；高反应；低反应）

2001年国际血栓与止血学会规定高滴度抑制物＞5BU；低滴度抑制物≤5BU。高反应型：输注FⅧ后抑制物滴度升高5BU以上；低反应型：输注FⅧ后抑制物滴度仍小于5BU。

（六）血友病B伴FⅨ抑制物

FⅨ抑制物是体内产生的特异性抑制或灭活FⅨ促凝活性，引起FⅨ水平降低的抗FⅨ抗体，包括：血友病B患者输注FⅨ制品替代治疗后产生灭活FⅨ活性的同种异体抗体；非血友病B患者自发产生的自身免疫性抗FⅨ抗体引起出血并发症（亦称获得性血友病B）。血友病B伴FⅨ抑制物发生率为1%~3%。

与抗FⅧ抗体不同的是抗FⅨ抗体在体外活性为即刻免疫反应（超敏反应），不依赖时间与温度。如果反复、大剂量输注FⅨ可产生肾病综合征（如免疫耐受诱导治疗）。

实验室检查：FⅨ:C减少；FⅨ抑制物呈即刻灭活FⅨ:C特点，不呈时间和温度依赖性。FⅨ抑制物定量（Bethesda法）测定（同 FⅧ抑制物检测）。

由于抗原/抗体呈快速反应，FⅨ抑制物与FⅧ抑制物显示出不同的酶动力曲线，与FⅨ进行完全且快速的抗原抗体反应。抗FⅨ IgG在体外的活性为即刻免疫反应，不依赖时间与温度，见表2。

表2 FⅧ抑制物与FⅨ抑制物不同生物学特点FⅧ抑制物FⅨ抑制物

IgG：IgG4 亚型

无免疫复合物病

某些FⅧ抗体具有蛋白水解特性IgG：IgG4为主

45% FⅨ过敏反应

反复、大量输注FⅨ可发生肾病综合征

体外活性：依赖温度与时间体外活性：即刻（非温度与时间依赖）

检测同Bethesda方法（无需孵育）

方法：患者血浆中加入等量外源性FIX（正常混合血浆），37℃孵育10分钟后进行FⅨ:C检测。1个单位FⅨ抑制物的定义为：在37℃条件下，10 分钟内灭活50%FⅨ活性的抑制物的量。