FVIII抗体检测
FVIII自身抗体的自身免疫性疾病
0.8
0.4
103
122
103
80
一. FVIII抑制物定义
• 体内产生的具有灭活凝血因子VIII促凝活性（FVIII:C）的抗体 （即中和抗体）引起FVIII水平降低，包括两大类：
–同种免疫抗体（allo- antibodies）:
• 血友病（HA）患者输注FVIII制品后产生的抗FVIII抗体
• 空腹血糖、肾功能、电解质均正常；肝功能：ALT 106U/L，AST 56U/L，ALB、TBIL、DB正常；甲功七项、肿瘤三项、贫血三项 均正常；CRP 19.9mg/L，ASO、RF正常，IgA 1.2g/L，IgG 4.0g/L↓，IgM 0.24g/L↓，C3、C4正常；乙肝两对半：HBsAb、 HBeAb、HBcAb阳性；HBV-DNA荧光定量 <500IU/ml；术前免疫 三项正常；ENA抗体全套、ANCA、ACA均正常；地贫一套、 G6PD活性、Coombs test及Hams test均正常；
• 结合病史及上述检查结果，基本排除血管性血友病、结 缔组织疾病、血小板减少性紫癜、肿瘤、药物、家族遗 传等原因致凝血功能异常，考虑患者第二次妊娠产生Ⅷ 抑制物致使Ⅷ因子缺乏，
• 诊断：获得性血友病A。
治疗观察表 1
血浆 (ml/d) 凝血因Ⅷ
(U)
地塞米松(mg/d)
20/9 400 1800 10
–自身免疫抗体（Auto-antibodies ，获得性FVIII抑制物)
• 非血友病患者自发产生的抗FVIII抗体-获得性血友病
二、获得性血友病A (AH）
• 非血友病A患者体内自发性产生针对FVIII的特异性自身免疫性抗体, 中和或灭活FⅧ活性，引起FⅧ水平降低，导致临床严重，甚至威胁 生命的出血。
血管性血友病
重要生理功能：
出血
vWF--作用
血栓
FⅧ的载体
介导血小板与血管内下组织的粘附 促进血小板聚集
第12页，共34页。
vWF--结构
1.FⅧ的载体：FVIII+Dˊ 2.介导血小板与血管内下组织的粘附：胶原+A3 3.促进血小板聚集：血小板特异性膜受体GPIbα+A1
4. 金属蛋白酶ADAMTS13+A2
2A型：缺乏高-中分子量vWF多聚体，导致血小板依赖性的功能减弱 2B型：对血小板膜GPⅠb亲和性增加，使高分子量vWF多聚体缺乏 2M型：对血小板膜GPⅠb亲和性下降，vWF多聚体分析正常 2N型：vWF对因子Ⅷ亲和力明显降低
➢ 3型：vWF量的完全缺失，在数量、结构与功能都存在异常(<1%)
第9页，共34页。
第30页，共34页。
治疗
➢ 非替代治疗--明显改善止血功能 1-去氨基-8-D精氨酸加压素（Ⅰ型） 抗纤溶药物
雌激素治疗
➢ 替代治疗（Ⅱ型 Ⅲ型） ➢）输注含有vWF-FVIII复合物的血液制品
第31页，共34页。
病例
连某某，女，14岁，学生。因阴道流血17天，头晕，心悸7天人院。 患者末次月经于人院前17天来潮，初起时出血量似平常月经量，后来逐渐增多，
第23页，共34页。
③vWF胶原结合分析试验(vWF：CBA)
Ⅲ型胶原包被微孔板
HRP
兔抗人vWF IgG
血浆中vWF PBS 1：400稀释
用1：200-1：8000梯度稀释的正常人混合血浆建立标准曲线， 然后以受检标本吸光度值查出对应的vwF：CBA活性值(％)。
第24页，共34页。
试验
血友病A FVIII与免疫
在A型血友病FVIII免疫应答：关于风险因素的概述堪机阿卡沙.戈什及.朽迈提.的蒂线上发表于2009年1月17日2009年Humana公司新闻抽象发展的抑制剂也许是最严重的并发症，凝血因子VIII （FVIII）更换治疗几乎可以排除高效的临床A型血友病患者的很大努力的管理。
因此，我们一直专注于改善FVIII抗体的形成的原因并找到替代的治疗方法。
几个患者相关因素已涉及到的风险抑制剂的发展，如种族，FVIII基因突变类型，家族病史的抑制剂，HLA单倍型，IL10基因的启动子区域的多态性，肿瘤坏死因子的单核苷酸多态性的α基因，等等。
除了遗传决定因素，有几个非遗传因素主要包括治疗喜欢的类型和特点用于治疗凝血因子浓缩物的纯度，在初始治疗时的年龄，初始剂量精矿，模式输液，手术，给药频率之前抑制剂的发展，和强度的治疗或定期预防。
在早期的炎症过程中童年是正在讨论的环境因素，以及免疫应答抗原、无法改变的遗传风险和环境因素可能增加或减少的抑制剂在个别病人的风险。
此外，还有其他的影响FVIII抑制剂的发展因素，例如压力原因，年龄，恶性肿瘤，感染，妊娠，抗生素等。
在这种情况下，抑制剂发生在没有血友病的和正常血浆的FVIII水平。
收购抑制剂的FVIII nonhemophiliacs（抗体）造成进一步的挑战治疗，这往往伴有显着发病率和死亡率。
预后的情况下，自身抗体有关的潜在的疾病过程和被与高死亡率。
为了更好地了解这些复杂的相互作用可能导致的发展预防措施，以尽量减少抑制物的形成。
可改变的危险因素的抑制因子形成提供预测的关键，也许是防止在血友病患者中形成的抑制剂。
关键词：FVIII抑制因子A型血友病MHC单倍型预防措施获得性血友病介绍抗体中和的促凝血功能FVIII，被称为抑制剂，在血友病中仍然可能是最严重的并发症的凝血因子替代疗法【1】。
这些患者中的各种出血发作的频率和出血量的几倍升级使管理变得极其困难【2】。
显然，该抑制剂是治疗因患病率的增加而增加FVIII血友病患者的治疗强度浓缩物和重组FVIII在诱导这些患者的常规治疗方案。
血友病伴抑制物的解读及处理
七、抑制物实验室诊断
（参照WFH实验室手册）
1、筛选试验： APTT延长，PT，TT正常， 2、纠正试验：延长的APTT不能被正常血浆纠正；
FⅧ:C减少，且随孵育时间呈进行性下降。 3、FVIII抑制物滴度测定 (Bethesda方法) ： 4、Nijmegen改良法：将患者血浆与缓冲后的正常人血浆共同温育
同种免疫抗体（allo- antibodies）: 血友病（HA）患者输注FVIII制品后产生的抗FVIII抗体
自身免疫抗体（Auto-antibodies ，获得性FVIII抑制物) 非血友病患者自发产生的抗FVIII抗体
血友病患者接受凝血因子(未接触过外源性蛋白)治疗后体内免疫反 应产生的特异性抗体-中和或抑制FVIII/FIX活性，引起FVIII/FIX降低， 导致临床难以控制的出血，对以往的治疗无效。
应对并发症 立足关节保护 -处理好紧急与重要
应对并发症：
紧急
抑制物、关节手术、理疗、急性出 血事件等一系列临床问题
重要
立足于关节保护的预防治疗
1、重要：预防治疗是减少血友病 应急事件发生的有效方法；
2、定期对患者进行评估（结构、 功能和参与度）
血友病伴抑制物解读及处理
安徽省立医院血液科
.
.
吴竞生
一. FVIII抑制物定义
（一）患者相关因素
种族区别 非洲裔、拉丁裔美国人50%＞白种美国人25% 可能rFVIII产品基因型与黑人患者基因型不匹配有关
家族、兄弟 兄弟50% ＞远亲10%
Malmo 兄弟研究 RR 3.2 较年轻的兄弟易受累
1、遗传因素
2、抑制物产生的时间与暴露天数
• Median exposure 9-36 days
获得性血友病的诊断和治疗.pptx
❖ 抗体产生机制：免疫病相关炎性反应会导致 急性相反应蛋白（IL-6、CRP）被抗原提呈 细胞提呈给免疫系统，免疫系统细胞产生自 身抗体。FVIII就是这样一种蛋白，可以部分 解释获得性FVIII抗体的产生。
❖ 2、妊娠/分娩后出现FVIII自身抗体 据六组 854例的统计,占6.0%~21%。表现为分娩后1 个月~1年内出现出血症状。预后良好,97% 患者可以治愈。
狼疮抗凝物存在
APTT正常（被纠正） 测FVIII:C/、FIX:C、FXI:C、FXII:C 缺乏FVIII:C/、FIX:C、FXI:C、FXII:C
凝血因子缺乏
图1 混合血浆试验示意图
❖ 2、诊断试验 （1）Bethesda试验：检测患者血浆中的抗体灭活正
常人血浆中的FVIII的能力。一个Bethesda单位定义 为检测系列中，剩余的FVIII:C为50%时的患者血浆 稀释度。本试验对血友病A出现抑制物较为敏感， 对AH不甚敏感，尤其对AH抗体滴度低时。
病
全身性自身免疫性 类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、
疾病
Sjogren’s综合征、溃疡性结肠炎、皮肌
炎、同种骨髓移植后移植物抗宿主病
器官特异性自身免 疫性疾病
重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺 肿、自身免疫性溶血贫血、自身免疫性甲 状腺功能减退、天疱疮、局限性大疱性类 天疱疮、多形性红斑、疱疹样皮炎、 GoodPasture综合征、sicca综合征（干燥 综合征）、巨细胞动脉炎、哮喘、单克隆 免疫球蛋白血症、冷球蛋白性贫血
CLL、红白血病、淋巴 病、多发性骨髓瘤、 MDS、Castheman病 等
❖ 抗体产生机制：Ｔ细胞对未知抗原/B细 胞与T细胞之间相互作用产生异常反应导 致免疫功能失调。例如，CLL患者CD+5 的B细胞亚群扩增导致针对FVIII的抗体 产生增加。
出血性疾病的实验室检测
抑制物
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1 mix 40s
• APTT不被纠正 • 抑制物存在
Mixing test 结果解释
aPTT results
Example
123
A -- normal plasma
30” 30” 30”
B -- test plasma
• PT延长＞3′， APTT延长＞5′ • 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 • 即刻检测，37°C孵育2h后检测 • 结果判断： ＞X+2SD 不纠正
Mixing test 结果判断
因子缺陷
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1mix 32s
• APTT被纠正 • 因子缺陷
• 基于 APTT凝固法 • 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 • APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 • 制备标准曲线
FVIII:C检测
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
质量控制
• 标准曲线和待检标本分析前准备条件必须在相同 • 标准曲线检测FVIII:C范围尽可能宽 • 稀释倍数: 标准曲线至少3个稀释度
抑制物检测方法
• Bethesda法 • Nijmegen modification
狼疮抗凝物质检测
相关概念
aCL aPL β2GP1 LA
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 Β2-糖蛋白1
ELISA法检测抗心磷脂的抗体 抗体依赖或不依赖β2GP1
IgG，IgM或IgA抗体，靶蛋白是心磷脂、 β2GP1或凝血酶原，靶蛋白与磷脂结合
One-Stage Factor VIII Bioassay
凝血因子抗体检测(王学锋)
1:5
1:10
49.3
54.9
77.3
83.8
48.6
54
95.5
96.8
58.2
67.5
147
150
42.8
49.9
93
93
35.7
39.8
77.8
77.6
1:20
1:40
1:80
61
65.5
70.9
84.8
Blank=4u/dL
59.7
65.7
71.8
96.3
Blank=<1u/dL
76.5
86.7
1
111
9
2
116
10
3
100
11
4
110
12
5
108
13
6
110
14
7
105
15
8
120
Байду номын сангаас
16
mean
Factor VIII activity 110 120 110 120 113 110 110 112
110
在使用时，需将Nijmegen血浆进行稀释，使其终浓 度为100%
3.检测：
准备患者血浆、标准品和质控品，若怀疑 FVIII抗体滴度较高，需将患者血浆进行一定 比例的稀释，常用稀释度为：1/2，1/4，1/8， 1/16，加入等量Nijmegen血浆后置于37℃水 浴2小时（加盖）
• Type 2 抗体：II型酶动力曲线，灭活FVIII量 不呈时间依赖性，表现为所取得的BU值与 稀释度不成正比。
Type I型抗体结果判读
剩余FVIII活性（%） 结果报告
血友病
替代治疗方案（获取因子受限时 ）
治疗：其他药物治疗
3 2 1
抗纤溶药物：
泌尿系统出血时禁用抗纤 溶药物，避免与凝血酶原 复合物合用。
ＤＤＡＶＰ：０.３ ｕｇ／ｋｇ（每次
常用的有氨甲 环酸、止血芳 酸、6-氨基己 酸等。
），主要用于轻型
血友病 A。
抑制物的处理
急性出血治疗：
血友病A：低滴度者可以加大剂量使用凝血因子Ⅷ制剂，高滴度者使 用人基因重组的活化FVII制剂或凝血酶原复合物； 血友病B：低滴度者可以加大剂量使用凝血因子Ⅸ制剂，高滴度者使 用人基因重组的活化FVII制剂控制出血。
家庭治疗
血友病患者在发生出血后自行或者由家属输注凝血 因子，可实现理想的早期治疗，达到缓解疼痛、 减少功能障碍以及远期残疾的发生，并显著减少 住院治疗天数。家庭治疗只有在患者及家属得到 充分培训后才可进行，且必须处于 可以促进肌肉、关节积血吸收，维持和增强肌肉
实验室检查
血友病Ａ患者FVIII:C减低或缺乏，ＶＷＦ:Ａｇ正常。 FVIII:C/ＶＷＦ:Ａｇ比值明显降低。血友病B患者FIX:C减低 或缺乏。
4、抑制物检测：若出现治疗效果不如既往，应考虑患者可 能产生了抑制物，应进行凝血因子抑制物滴度测定。有条 件的患者应该在开始接受凝血因子治疗后的前50个暴露日 定期检测抑制物。此外，患者接受手术前必须检测抑制物。
Utrecht方案
每次15-30U/kg.d-1,
中国血友病协作组
血友病A患者： FVIII制剂10U/kg, 每周两次； 血友病B患者： FIX制剂10U/kg, 每周一次；
每次25-40U/kg.d-1, 血友病A每周给药 3次。 血友病B每周给药 2次。
血友病A每周给药
凝血因子VIII活性（FVIII：C）测定
出凝血10.1 凝血因子V I I I活性（FV I I I：C）测定（第四版）出凝血10.2原理：凝血因子VIII活性是通过其纠正乏VIII因子血浆所致的凝固时间延长的能力而测得的。
将稀释已知凝血因子VIII活性的血浆与乏VIII 因子血浆的混合物做部分凝血活酶时间（APTT）测定，建立参考曲线，该曲线能将受检者血浆的APTT值转化为VIII因子活性单位。
受检者血浆与乏VIII因子的基质血浆混合，测其APTT值，将受检者血浆的测定结果在标准曲线上计算其凝血因子VIII的活性。
出凝血10.３标本处理：患者处于休息状态下，采空腹静脉血（急诊病人除外）。
采血者应技术熟练，“一针见血”，以防止组织损伤，使外源性凝血因子进入标本。
最好不与其它实验一起采集而使血液停留在针管的时间延长。
采完血后，将血液沿管壁缓缓注入试管，避免产生气泡；然后迅速将血液和抗凝剂轻轻颠倒混匀，避免用力震荡。
全血要在1小时内分离血浆。
分离乏血小板血浆时，要在室温下3000rpm离心10分钟，室温下可存放4小时。
全部试验不能在4小时内完成，应将乏血小板血浆分装在0.5～1.0ml的小试管中快速冷冻，储存于-20℃冰箱中。
冷冻过的标本不能再次冷冻，否则结果会不准确。
冷冻血浆融化时，应将盛冷冻血浆的容器置于37℃水浴中，并轻轻摇动，使其迅速融化。
标本在-20℃可保存2周。
-70℃可保存6个月。
出凝血10.４试剂：试剂购于天津威士达公司1）APTT试剂：德灵Actin试剂（试剂盒代号527165）。
每瓶试剂内含磷脂（从兔脑中提取），1.0×104mol/L糅花酸，稳定剂；共2ml。
2）乏VIII因子血浆（德灵，产品号OTXW）3）0.025 mol/L氯化钙每瓶乏VIII因子血浆用蒸馏水1ml复溶。
室温平衡15min后上机分析。
复溶的乏VIII因子血浆分装为0.1ml/支，-70℃可保存60天。
实验前应37℃快速解冻，轻轻颠倒混匀备用。
2023血友病合并抑制物诊断与治疗中国指南(完整版)
2023血友病合并抑制物诊断与治疗中国指南（完整版）一、概述抑制物是血友病患者接受外源性凝血因子VIIl/lX(FVIIl/F IX)输注后产生的抗FVIIl/FIX同种中和抗体。
抑制物是血友病治疗过程中最严重、最棘手的并发症。
中华医学会血液学分会血栓与止血学组、中国血友病协作组千2018年制订了《凝血因子VIIl/lX抑制物诊断与治疗中国指南》。
此后，又分别对国内同行和血友病患者进行了抑制物诊治现状的专项调查，结果表明有关人员对千血友病合并抑制物的认知水平有了较大提高，也有不尽如人意之处。
近年的研究揭示了血友病合并抑制物的发病机制，同时新药的不断涌现也为抑制物患者出血的预防及治疗提供了更多的选择。
为进一步提高对血友病合并抑制物的认识，作到发现及时、处理规范，特制订此指南供国内同行参考。
二、基本概念详见《凝血因子V!Il/lX抑制物诊断与治疗中国指南(2018版）汃三、推荐等级根据GRADE方法，本指南推荐等级如下：1级推荐：相当千”指南推荐＂，代表该推荐对患者的安全性及获益明显高千风险和负担。
1B级：该推荐至少有—项观察性或干预性研究的数据支持，且该推荐在大多数渭况下适用千大多数患者；1C级：该推荐缺乏此类证据支持，但是仍然对患者的安全或获益很重要。
2级推荐：相当于”指南建议”，用千表示较弱的推荐，该建议可能会随着更新证据的出现发生改变。
2B级：病例登记或研究数据支持该建议；2C级：无前述数据支持。
四、FV!Il/FIX抑制物（同种抗体）的危险因素抑制物发生的危险因素包括遗传因素和非遗传因素。
遗传因素主要有疾病严重程度、种族和家族史、基因突变类型等。
F8基因突变类型是最重要的抑制物产生危险因素。
与重型血友病A(HA)患者产生抑制物密切相关的主要突变类型包括大片段缺失、无义突变、22号内含子倒位，其次为小片段缺失和插入、错义突变等。
不同类型的基因突变导致抑制物产生的风险差异，可能与体内存在FVIll抗原量有关。
FVIII抗体检测
FVIII抗体检测FVIII抗体检测⼆、实验室诊断（⼀）初筛试验凝⾎酶原时间（PT）、凝⾎酶时间（TT）正常，活化部分凝⾎活酶时间（APTT）延长。
（⼆）纠正试验（证实有时间依赖性的抑制物存在）延长的APTT不能被正常混合⾎浆纠正。
多数⾎友病患者替代治疗后产⽣抑制物显⽰特征性模式，即患者⾎浆与正常混合⾎浆按1:1⽐例混合后的即刻APTT结果介于两种分别检测的APTT结果之间，但当37℃混合温育1~2⼩时后检测APTT，其APTT结果进⼀步延长。
（三）确诊试验FⅧ:C减少，且随孵育时间呈进⾏性下降。
（四）抑制物定量测定（Bethesda⽅法；Nijmegen改良法）1. Bethesda法（1975年，Kasper）（1）试验原理：⾎友病A患者产⽣的FⅧ抑制物呈时间依赖性。
在含抑制物的⾎浆中加⼊⼈源或猪源FⅧ，37℃混合温育，随孵育时间延长，FⅧ被抑制物逐渐中和。
如加⼊FⅧ的量和孵育时间标准化，则可根据FⅧ被中和的量，以Bethesda单位的⽅式确定抑制物滴度。
（2）检测⽅法：将患者⾎浆与正常混合⾎浆按⼀定⽐例混合，37℃温育2⼩时后，测定该混合物中剩余的FⅧ :C⽔平。
1BU 的定义：能使⾎浆中FⅧ:C降低50%的抑制物活性为1个Bethesda单位（BU）。
患者⾎浆稀释倍数的倒数为患者⾎浆抗体滴度的BU值。
（图1）图1. 抑制物检测（Bethesda法）（3）操作步骤1）将患者⾎浆⽤OVB缓冲液按⼀定⽐例倍⽐稀释，⼀般做多个稀释倍数，样本⼀直置于冰上保存。
如果之前有关于抑制物检测的相关资料，则可作为参照对样本进⾏适当的稀释。
2）将正常混合⾎浆（FⅧ浓度已经过标准化检测）等量加⼊每份待测的稀释⾎浆样本中，FⅧ浓度通常为100 IU/dl。
因此，每份混合物的FⅧ起始浓度⼤约为50 IU/dl。
3）37℃孵育2⼩时后进⾏FⅧ:C检测，采⽤正常混合⾎浆和乏FⅧ⾎浆的混合物作为标准品进⾏定标，并以该标准曲线来计算其它混合物的FⅧ活性。
出凝血疾病检测
≥119.4（39.2；75.6） %
≥102.3（41.3；71.6） % ≥59.4（27.0；47.5） %
143.4
S
56.4
S
2.5
提示狼疮抗凝物存在。
参考范围 11-14 0.87-1.2 23.7-36.0 13.3-19.3 2-4 50-150 50-120 50-120 50-120 31-44 30-38 0.8-1.2
阳性：DRVVTScreen/DRVVT Comfirm > 1.2
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
患
者
血 浆
0.2ml咪唑
0.2ml咪唑
0.2ml咪唑
0.2ml咪唑
未稀释
1:1
1:2
1:4
1:8
0.2mlNPP+0.2ml咪唑
取0.2ml+0.2mlNPP
37℃孵育2小时
检测因子活性
Bethesda Assay操作步骤
解释
原因
正常
功能正常
胶原/肾上腺素结果异常而 通常为阿司匹林 胶原/ADP结果正常，这种 情况表明血小板存在功能异 常，通常见于阿司匹林样药 物影响
异常
异常
两种结果均异常表明存在血 血小板功能异常，药 小板功能异常，vWD或者 物，vWD 药物影响
9
血小板聚集试验
血小板与血小板之间相互粘附过程。是形成血小板血栓的基础，也是血小板进一步活化 和参与二期止血、促进血液凝固的保证。
纤溶系统： 纤溶酶原 tPA PAI-1 D-dimer FDP
易栓症
遗传性： 1、抗凝蛋白缺陷：ATIII、PC、PS 2、凝血因子缺陷：FV Leiden/FII 20210A、异常纤维蛋白原血症 3、纤溶蛋白缺陷：纤溶酶原、tPA缺乏、PAI-1增加 4、代谢缺陷：高同型半胱氨酸血症 获得性 恶性肿瘤、APS、肝病、肾病、凝血因子增加、创伤及围手术期、妊娠、制 动、经济舱综合征、避孕药、老龄等等
FVIII抑制物检测SOP
三、试剂 咪唑缓冲液 OBS缓冲液 正常人混合血浆 乏FVIII血浆 APTT试剂
四、方法 人因子VIII浓缩物 1.用咪唑缓冲液在塑料试管中倍比稀释受检血浆(1/2，1/4，1/8，1/16，等)，终体积
为0.2ml－受检管。 稀释倍数因人而异，建议起始点不作稀释，接下来倍比稀释，1/2，1/4，等。 注意：如病人先前做过抑制物检测，其抑制物水平能帮助我们对本次检测的稀释倍数做
Verbruggen B, Novakova I, Wessels H, Boezeman J, van den Berg M,MauserBunschoten E.The Nijmegan modification of the Bethesda Assay for factor VIII:C Inhibitors: improved specificity and reliability. Thrombosis & Haemostasis 1995 73: 247-251. (For the Nijmegenmodification.)
纠正程度差见于： 分别孵育后制备的混合血浆中含有即刻作用抑制物 孵育后的混合血浆中含有时间依赖的抑制物
二、器材 移液器 测定管 冰盒 水浴箱
三、试剂 正常血浆（20人份的混合血浆） 待测血浆 APTT试剂
四、方法 准备3个塑料管—A，B和C。在A管内加入0.5ml正常血浆，B管内加入0.5ml待测血浆， C管内加入正常和待测血浆各0.2ml 37℃孵育60分钟 将上述试管置冰盒中 检测前将A管和B管血浆按1：1即刻混合 A，C，D和B管依次进行复管APTT检测。
六、计算抑制物浓度 稀释的受检血浆剩余FVIII水平接近50%，介于30-60%，这正是计算抑制物含量的范围。
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FVIII抗体检测二、实验室诊断（一）初筛试验凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）正常，活化部分凝血活酶时间（APTT）延长。
（二）纠正试验（证实有时间依赖性的抑制物存在）延长的APTT不能被正常混合血浆纠正。
多数血友病患者替代治疗后产生抑制物显示特征性模式，即患者血浆与正常混合血浆按1:1比例混合后的即刻APTT 结果介于两种分别检测的APTT结果之间，但当37℃混合温育1-2小时后检测APTT，其APTT结果进一步延长。
（三）确诊试验FⅧ:C减少，且随孵育时间呈进行性下降。
（四）抑制物定量测定（Bethesda方法；Nijmegen改良法）1. Bethesda法（1975年，Kasper）（1）试验原理：血友病A患者产生的FⅧ抑制物呈时间依赖性。
在含抑制物的血浆中加入人源或猪源FⅧ，37℃混合温育，随孵育时间延长，FⅧ被抑制物逐渐中和。
如加入FⅧ的量和孵育时间标准化，则可根据FⅧ被中和的量，以Bethesda 单位的方式确定抑制物滴度。
（2）检测方法：将患者血浆与正常混合血浆按一定比例混合，37℃温育2小时后，测定该混合物中剩余的FⅧ :C水平。
1BU的定义：能使血浆中FⅧ:C 降低50%的抑制物活性为1个Bethesda单位（BU）。
患者血浆稀释倍数的倒数为患者血浆抗体滴度的BU值。
（图1）图1. 抑制物检测（Bethesda法）（3）操作步骤1）将患者血浆用OVB缓冲液按一定比例倍比稀释，一般做多个稀释倍数，样本一直置于冰上保存。
如果之前有关于抑制物检测的相关资料，则可作为参照对样本进行适当的稀释。
2）将正常混合血浆（FⅧ浓度已经过标准化检测）等量加入每份待测的稀释血浆样本中，FⅧ浓度通常为100 IU/dl。
因此，每份混合物的FⅧ起始浓度大约为50 IU/dl。
3）37℃孵育2小时后进行FⅧ:C检测，采用正常混合血浆和乏FⅧ血浆的混合物作为标准品进行定标，并以该标准曲线来计算其它混合物的FⅧ活性。
本检测中，此混合物的FⅧ:C为100%。
4）根据残余FⅧ与抑制物单位的关系图计算抑制物的浓度。
（4）结果解释：Bethesda试验结果解释见表1。
表1. Bethesda试验的结果解释滴度（BU/ml）结果解释＜0.5 不显著0.5~5 存在低浓度抑制物：——可以被过量的FⅧ纠正——可能是低反应型＞5 存在高浓度抑制物：——FⅧ不起作用——免疫记忆反应，产生更多抑制物（高反应型）2. Nijmegen改良法（NA）（1）试验原理：在正常混合血浆中加入0.1mol/L、pH7.4咪唑缓冲液。
由于使用了缓冲体系，使反应中pH值更加稳定，提高试验准确性与敏感性，适合低滴度抗体的检测，受到世界血友病联盟（World Federation of Hemophilia，WFH）的推荐。
（2）试验方法：将患者血浆与缓冲后的正常混合血浆于37℃共同温育2小时，以保证体系pH稳定。
以正常混合血浆与乏FⅧ血浆组成的对照混合物（和患者血浆混合物在同样条件下温育）为标准品制备标准曲线，其余样本按照该标准曲线检测残余FⅧ水平。
采用假定100%残余FⅧ= 0BU/ml，50%残余FⅧ= 1BU/ml （国际上认可的抑制物活性转换方式）而建立的残余FⅧ和抑制物之间的相互转换的双对数曲线，将残余FⅧ转换为抑制物单位。
当残余FⅧ活性＜25%，必须稀释后重新检测患者血浆，以免低估抑制物的滴度。
规定抑制物滴度≥0.6BU/ml 为阳性（具有显著性临床意义）。
（3）操作步骤：使用咪唑缓冲液作为稀释液，将患者血浆进行倍比稀释，建议从原倍开始，1/2、 1/4、以此类推，每管总体积为0.2 ml。
如果患者之前接受过抑制物检测，其检测结果可作为稀释度的大致指南。
如果患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。
其余步骤同Bethasda方法。
（4）结果解释：应选择残余FⅧ含量接近50%的稀释度，但也可选择残余F Ⅷ在30%~60%范围内的待测血浆稀释倍数用于抑制物的计算，只需计算每份稀释度的结果，取平均值即可。
根据抑制物单位的定义，以残余FⅧ%-抑制物单位在双对数曲线上绘制标准曲线。
读取每份待测混合样本中残余FⅧ相对的抑制物水平，并以稀释倍数进行校正。
例如：（1/4 稀释 + 正常混合血浆）残余FⅧ= 50%，抑制物单位（根据图表）= 1 BU，乘以稀释倍数（4倍稀释）= 4BU抑制物的诊断通常要以至少2次抑制物滴度阳性为准，包括患者过去对治疗的反应及平时的药代动力学（pharmacokinetics，PK）研究。
（五）抑制物的分类（高滴度；低滴度；高反应；低反应）2001年国际血栓与止血学会规定高滴度抑制物＞5BU；低滴度抑制物≤5BU。
高反应型：输注FⅧ后抑制物滴度升高5BU以上；低反应型：输注FⅧ后抑制物滴度仍小于5BU。
（六）血友病B伴FⅨ抑制物FⅨ抑制物是体内产生的特异性抑制或灭活FⅨ促凝活性，引起FⅨ水平降低的抗FⅨ抗体，包括：血友病B患者输注FⅨ制品替代治疗后产生灭活FⅨ活性的同种异体抗体；非血友病B患者自发产生的自身免疫性抗FⅨ抗体引起出血并发症（亦称获得性血友病B）。
血友病B伴FⅨ抑制物发生率为1%~3%。
与抗FⅧ抗体不同的是抗FⅨ抗体在体外活性为即刻免疫反应（超敏反应），不依赖时间与温度。
如果反复、大剂量输注FⅨ可产生肾病综合征（如免疫耐受诱导治疗）。
实验室检查：FⅨ:C减少；FⅨ抑制物呈即刻灭活FⅨ:C特点，不呈时间和温度依赖性。
FⅨ抑制物定量（Bethesda法）测定（同 FⅧ抑制物检测）。
由于抗原/抗体呈快速反应，FⅨ抑制物与FⅧ抑制物显示出不同的酶动力曲线，与FⅨ进行完全且快速的抗原抗体反应。
抗FⅨ IgG在体外的活性为即刻免疫反应，不依赖时间与温度，见表2。
表2 FⅧ抑制物与FⅨ抑制物不同生物学特点FⅧ抑制物FⅨ抑制物IgG：IgG4 亚型无免疫复合物病某些FⅧ抗体具有蛋白水解特性IgG：IgG4为主45% FⅨ过敏反应反复、大量输注FⅨ可发生肾病综合征体外活性：依赖温度与时间体外活性：即刻（非温度与时间依赖）检测同Bethesda方法（无需孵育）方法：患者血浆中加入等量外源性FIX（正常混合血浆），37℃孵育10分钟后进行FⅨ:C检测。
1个单位FⅨ抑制物的定义为：在37℃条件下，10 分钟内灭活50%FⅨ活性的抑制物的量。
凝血因子Ⅺ、Ⅻ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅱ、Ⅶ、Fg抑制物罕见，其诊断可参照FⅧ抑制物检测，故本章不再赘述。
三、检测方法的特性（一）抑制物检测的误区和局限性1. 抑制物检测的误区（1）当残余FⅧ活性＜25%时，易低估抑制物的滴度，必须稀释后重新检测患者血浆。
（2）如患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。
（3）残余FⅧ＜25%或＞75% 的其他任何稀释度均不得用于计算抑制物的含量。
（4）重型血友病A患者进行抑制物定量检测时，其样本FⅧ含量很低或不能测出。
如待测血浆中含有5 IU/dl以上的FⅧ，则在计算抑制物滴度时必须予以考虑。
可采用如下三种方法：方法1：在对照混合样本中加入比待测混合样本更多的因子，以补偿待测混合样本中的FⅧ。
如待测血浆中含20 IU/dl FⅧ，则对照混合样本则由120μl正常混合血浆和80μl乏FⅧ血浆制成（在孵育开始时，待测和对照混合样本中均含有大约60 IU/dl的FⅧ）。
方法2：分析前于58℃将待测血浆加热灭活90分钟，破坏所有凝血因子，包括FⅧ。
由于免疫球蛋白具有耐热性，因此，抑制物的滴度不受这种处理方式的影响。
方法3：在对照混合样本中使用的乏FⅧ血浆非常重要。
应包含正常水平的vWF，已证实如果乏FⅧ血浆不含vWF，则抑制物滴度可降低30%~50%。
2. 抑制物检测的局限性（1）一期法检测局限性1）如果存在狼疮抗凝物则有干扰。
2）一期法检测的正常FⅧ:C结果不能排除轻度血友病A。
20%以上的轻度血友病A患者与此差异相关，表明不同检测系统所得结果存在着两倍差异。
一期法的结果往往比二期法或发色底物法的结果高两倍，甚至5倍。
少数患者一期法结果在正常值范围内，但二期法或发色底物法结果降低。
这些患者临床出血表型与二期法或发色底物法测得的低FⅧ:C一致。
约5%-10% 轻度血友病A患者一期法FⅧ:C正常，但基因分析确认为轻型血友病A，需采用二期法或发色底物法检测，即使APTT和一期法检测结果正常。
有些轻型血友病A一期法检测FⅧ:C下降，但是二期法或发色底物法测得结果正常，没有个人或家族出血病史，也无需 FⅧ:C替代治疗，其临床表型与发色底物法或二期法检测FⅧ:C一致。
经基因确认为轻度血友病 A 患者。
检测结果差异见表3。
表3 基因确认为轻度血友病 A 患者检测结果差异病例一期法（IU/dl）二期法（IU/dl）发色底物法（IU/dl）A 101 34 13B 88 15 28C 63 30 40D 55 24 40E 58 21 33F 72 21 36G 84 19 45（2） Bethesda方法（BA）的局限性1）非特异性假阳性高达32%，假阴性5%。
改良的Nijmegen方法（NA）通过缓冲正常混合血浆（buffered normal pool plasma，BNPP）和乏FⅧ血浆代替咪唑缓冲液作为参照样品提高敏感性和特异性。
此外建议：试验中加热去除剩余FⅧ、选用标准的FⅧ参照血浆、应用4 mol/L咪唑溶液以及剩余FⅧ与发色底物的作用，可进一步提高该方法的敏感性及特异性。
2）变异性大—室间质量评估（EQA）各种EQA团队证实实验室内部变异系数（CV）高达（有时超过）50%。
变异性大是由于检测变异性可发生在检测的任何阶段，包括检测试剂的选择和来源、缓冲液、BNPP等，即使相同的流程，也难以得到RCPA EQA程序中两个相同的参数。
虽然NA的变异性比BA低，但不同实验室NA的变异性同BA一样仍然很高。
实验室内部差异可统一试验方法和试剂，通过试验方法的标准化可以得到可接受的实验室内部变异。
3. 检测结果的偏差可发生在诊断过程中的任何阶段，包括分析前阶段（医师检测、标本收集），分析阶段，分析后阶段（实验结果解释和报告、医师的解释和处理）。
（1）分析前阶段：检查检测步骤的准确性及相关性（以确保检测正确实施）；核对和注意血液标本（准确的抗凝剂，适当填充等）；可避免误差及假阳性或阴性结果。
（2）分析阶段：了解检测的局限性如低抑制物敏感度；采用最优方法及已经验证的改良法（有助于保证准确性）；进行适当的内部质量控制并参与EQA（以确保准确性）；必要时重复检测（确保准确性，避免假阴性或假阳性）；（3）分析后阶段：当检验结果与预期值不匹配时用新样本重复检测；向临床医生提供咨询以协助检测结果的解释。
4. 抑制物检测的敏感性和特异性有待进一步提高BA和NA均对低抑制物活性缺乏敏感性。