斑马鱼的培养及TALENs技术的应用
TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程
TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html实验指南收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。
Tel ：010-********;E-mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。
E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。
⽹络出版时间:2013-3-515:03:12URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.htmlDOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程沈延,黄鹏,张博北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。
TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。
斑马鱼作为研究模型的应用与发展
斑马鱼作为研究模型的应用与发展斑马鱼是一种常见的淡水热带鱼，因其外观被广泛应用于美学领域，而在科学研究中也成为了重要的工具。
斑马鱼胚胎发育快、生命周期短、巨大的繁殖能力以及相对简单的遗传系统，使它成为研究发育生物学、神经生物学、药理学和遗传学等领域的优秀模型生物。
从其性状方面来看，斑马鱼的产卵较为容易，雌性斑马鱼每月可以产下300-400个卵子。
斑马鱼胚胎的发育阶段短，仅需1-2天就可以完成脊椎动物发育的最初几个小时。
它们的受精卵体积很小，可以进行高通量的药物筛选或遗传突变筛选。
正是这些方面的优势使斑马鱼成为了研究发育和遗传调控领域的研究模型。
在遗传学与基因组学研究方面，斑马鱼的基因组已经被彻底测序了。
它们仅有26条染色体，相当于人类染色体的一半。
12,000~13,000个基因与斑马鱼的身体结构、发育过程、生长和控制代谢有关。
这一基因与基因组学的基础研究为深入探究疾病、药物筛选等许多方面奠定了基石。
在对疾病的研究中，斑马鱼作为模型动物也正在逐步得到广泛应用。
例如，斑马鱼模型可以用于研究人类疾病的遗传病变，并且可以用来进行疾病模拟，如神经发育障碍、先天性心脏病等。
斑马鱼的生命力特别强，因此，可以将其用于对各种物质的毒性实验和药物筛选实验，在保证安全性的前提下，提高药物试验的效率。
此外，斑马鱼的神经系统也是其中一个备受关注的领域。
大量生理学与药理学研究利用斑马鱼的神经网络为研究平台。
例如，小鼠等作为动物模型观察老年痴呆症状是复杂的，且很难通过细胞或者神经网络的方法对其进行研究。
但是，斑马鱼的神经网络结构相对简单，例如从背根神经节开始，斑马鱼大脑仅有几百个神经元组成的而且都是浅表的，为研究神经网络提供了非常好的实验条件。
利用斑马鱼作为研究模型也有一些挑战。
例如，由于其种群自我更新时间相对较长，斑马鱼不能胜任复杂的进化研究，因此其遗传模型的适用范围也受到一定的限制。
另外，另一个方面是在斑马鱼研究中可能出现的生态中断现象。
斑马鱼模型动物的应用与前景
斑马鱼模型动物的应用与前景斑马鱼是一种小型热带淡水鱼类，常见于水族箱中。
而近些年来，斑马鱼模型在动物研究领域中被广泛应用。
斑马鱼模型是指将斑马鱼作为实验模型，通过人工操控、基因编辑等方法，研究其生命现象和机制，并应用到医学、药物研发、神经研究、毒理学、转化医学等领域。
一、斑马鱼模型在医学领域中的应用在医学领域中，斑马鱼模型被广泛运用到疾病模型的建立和药物筛选上。
其相较于哺乳动物模型具有价格低廉、生长迅速、繁殖能力强、体型小、幼鱼可透明等优势。
可以通过基因编辑技术将人体疾病相关的基因改变植入斑马鱼模型，从而模拟人体疾病。
如甲状腺激素缺乏症、舌咽神经痛等。
另外，通过药物筛选，可以快速选择出具有治疗作用的药物，为后期的药物研发提供重要的参考。
二、斑马鱼模型在神经研究领域中的应用斑马鱼模型还可以应用到神经研究领域中。
斑马鱼的中枢神经系统结构简单，同时具有高度透明性，可以直接观察到神经系统的发育和变化。
因此，斑马鱼模型被广泛应用到神经元的迁移、突触形成、神经细胞凋亡等神经发育研究上。
以突触发育为例，斑马鱼模型的发育周期较短，可以在较短的时间内观察到突触发育的变化，从而为更深入的神经系统研究提供基础。
三、斑马鱼模型在毒理学研究中的应用近些年来，毒理学研究中，对于环境污染物和化学物质的评估，始终是一个难点。
而且，对于大多数化学物质分析，动物实验又过于昂贵、耗时且对动物损伤较大。
因此，斑马鱼模型的应用被引入到毒理学研究中，成为一种有效、可预测且实用的模型。
其以短期、高通量的特点得到毒理学研究领域的广泛关注。
斑马鱼胚胎在短时间内就能产生反应，快速评估化学物质的毒性，从而增强毒性评估的先进性和准确性。
四、斑马鱼模型在转化医学中的应用斑马鱼模型具有高度的相关性，同时不受哺乳动物模型的限制，因此可以应用到转化医学领域中。
转化医学的概念是将基础研究和临床研究紧密结合，将实验室的研究成果快速转化为临床诊疗效应的新型医疗领域。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是现代生物技术的重要组成部分，通过改变生物体的基因组，使其具有新的特性或功能。
斑马鱼作为一种常见的实验动物模型，被广泛应用于生物学研究中。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖技巧，帮助研究者顺利进行相关实验。
一、斑马鱼胚胎的获取斑马鱼胚胎的获取是进行转基因实验的第一步。
通常情况下，斑马鱼胚胎可以通过自然产卵或人工授精获得。
为了提高产卵的效率，可以将斑马鱼置于特定的环境条件下，如适宜的水温和光照条件。
此外，还可以使用药物刺激促进斑马鱼产卵。
对于人工授精，可以将雄性和雌性斑马鱼分别放入相同的容器中，利用它们的自然产卵和受精过程来获得胚胎。
二、胚胎的培养获得斑马鱼胚胎后，需要进行胚胎的培养。
首先，将胚胎转移到培养皿中，添加适宜的培养液，如E3培养液。
E3培养液中含有必需的营养物质，可以为斑马鱼胚胎提供所需的营养。
同时，保持培养皿中的水温和光照条件也非常重要，通常将其保持在28-30摄氏度，并提供适量的光照。
三、转基因技术的应用在斑马鱼胚胎培养的基础上，可以进行转基因技术的应用。
目前，常用的转基因技术包括转基因敲除和转基因过表达。
转基因敲除是通过将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其失去特定基因的功能。
而转基因过表达是将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其在特定生理条件下过度表达。
这些转基因技术可以帮助研究者研究特定基因的功能和调控机制。
四、转基因斑马鱼胚胎的鉴定进行转基因实验后，需要对转基因斑马鱼胚胎进行鉴定。
常用的鉴定方法包括PCR、荧光显微镜观察和基因测序等。
PCR是一种常用的分子生物学技术，可以通过检测特定基因的存在来鉴定转基因斑马鱼胚胎。
荧光显微镜观察则是通过检测转基因斑马鱼是否发出特定颜色的荧光来鉴定。
基因测序则可以直接确定转基因斑马鱼胚胎中特定基因的序列，从而进行准确的鉴定。
五、转基因斑马鱼胚胎的进一步研究鉴定转基因斑马鱼胚胎后，可以进行进一步的研究。
例如，可以观察转基因斑马鱼胚胎在不同生理条件下的表型变化。
斑马鱼作为模式生物在发育生物学和遗传学研究中的应用
斑马鱼作为模式生物在发育生物学和遗传学研究中的应用自从19世纪开始，科学家们一直在通过选定某些模式生物，如斑马鱼、小鼠、果蝇等来深入研究生命的奥秘。
这些模式生物被广泛用于从发育生物学到遗传学的研究领域。
其中，斑马鱼由于拥有发育速度快，透明度高，繁殖周期短等优点，为科学家们提供了理想的实验材料。
本文将详细探讨斑马鱼在发育生物学和遗传学研究中的应用。
一、斑马鱼在发育生物学方面的应用1.1 受精和胚胎发育斑马鱼的成熟期很短，仅需3个月，且在水中繁殖，雄鱼和雌鱼在不经过人工干预的情况下会自行交配，产下千万个卵子。
这些特点使得斑马鱼成为了研究受精和胚胎发育的理想模式生物。
斑马鱼发育周期短，且在受精后仅需数小时即可胚胎发育，科学家们可以直观地观察到受精的过程和胚胎早期的变化过程。
这为我们对于生命的起源和胚胎形成等领域提供了独特的视角和参考。
1.2 器官发育斑马鱼器官发育过程也是发育生物学领域的一个重要研究方向。
研究人员可以通过基因改造，观察到不同基因表达出来对器官发育的影响。
例如，一项研究表明，在一个发育的胰腺中，Pdx1基因是发展为稳定胰岛细胞所必不可少的基因。
通过改变Pdx1的表达模式，科学家们成功地发现Pdx1对稳定胰岛细胞数量的影响，加深了我们对器官发育的了解。
1.3 神经发育斑马鱼神经系统发育与脊椎动物的其他模式生物非常相似，与小鼠等模式生物相比，斑马鱼生长速度快，且在早期神经系统发育阶段仍较为简单，因此可以更好地研究这些阶段中神经系统的构建和运作。
在神经发育领域中，斑马鱼的应用包括但不限于研究神经元的分布序列、神经细胞的形态和运动状态、神经元的自发活动等方面。
二、斑马鱼在遗传学方面的应用2.1 遗传显微镜在斑马鱼遗传学领域，另一个被广泛使用的是遗传显微镜。
这个显微镜是一个用于斑马鱼早期胚胎研究的特殊显微镜。
这个显微镜可以放大数倍，帮助科学家在斑马鱼胚胎中发现突变。
该显微镜的广泛使用在突变分析方面取得了重大成果，帮助我们在独特的水平上研究生命的启动机制。
斑马鱼模型以及其在遗传学实验研究中的应用
斑马鱼模型以及其在遗传学实验研究中的应用斑马鱼（Danio rerio）是一种小型热带淡水鱼类，广泛应用于生物医学研究领域。
它的快速发育、高繁殖能力和透明胚胎等特点，使得斑马鱼成为研究人类疾病和遗传学的理想模型生物。
在遗传学实验研究中，斑马鱼被广泛用于探索基因功能、疾病模拟、药物筛选、发育生物学等诸多方面。
斑马鱼模型的优势主要体现在以下几个方面。
首先，斑马鱼的特征使其成为遗传学研究的理想模型。
斑马鱼的基因组在许多方面与人类的基因组高度保守，大约70%的人类基因具有斑马鱼的同源基因。
这意味着，通过研究斑马鱼的基因功能，我们可以更好地理解人类基因以及与之相关的疾病。
其次，斑马鱼的胚胎发育速度极快。
斑马鱼的胚胎在受精后仅需24小时便可以孵化。
另外，斑马鱼胚胎的发育过程可以在显微镜下清晰可见，这意味着我们可以轻松观察到发育过程中的变化，并进行更加精确的实验观察。
此外，斑马鱼的胚胎透明，这一特点使得研究人员能够直接观察到内脏器官和神经系统的发育。
通过应用各类荧光探针或特定标记物，我们可以在斑马鱼胚胎中对特定基因或基因产物进行定位和可视化，从而更深入地研究其功能和作用机制。
斑马鱼模型在遗传学实验研究中有着广泛的应用。
首先，斑马鱼模型可以用于探索基因功能。
在遗传学研究中，研究人员可以使用各种基于遗传学、分子生物学和转基因技术的方法来扰乱或改变斑马鱼基因的功能，从而了解特定基因对发育和疾病的影响。
其次，斑马鱼模型可以用于疾病模拟。
斑马鱼的遗传相似性和发育过程相似性使其成为研究人类疾病的理想模型。
通过模拟人类遗传病或疾病相关基因突变，我们可以研究这些疾病的发病机制、生理学变化和潜在治疗策略。
此外，斑马鱼模型还可以用于药物筛选。
研究人员可以将药物添加到斑马鱼培养液或胚胎中，然后观察斑马鱼的发育、行为和生理特征，以评估药物的毒副作用和药效。
这种药物筛选方法可以加速药物开发和筛选过程。
最后，斑马鱼模型在发育生物学领域也有广泛应用。
斑马鱼的实验室养殖方法及其实验应用
及其在以上研究领域的应用。
关键词: 斑马鱼; 实验室; 养殖; 应用
中图分类号: Q 95-331
文献标识码: A
Zebra fish laboratory culture techniques
ZH O U Yin1, ZH AN G H ong-ling2 ( 1. Departm ent o f B io log ical and Pharm aceutical Eng ineering, W uhan Po lytechnic Un iversity, W uhan 430023, Ch ina;
14
武汉工业学院学报
2 010 年
斑马鱼的雌雄鉴别较为容易。雄性体侧的银蓝 色条纹偏黄, 间以柠檬色条纹; 雌鱼的体侧条纹偏蓝 而且鲜艳, 身体比雄鱼丰满粗壮, 尤其在性成熟后雌 鱼的腹部膨大。笔者在饲养过程中体会到在分别斑 马鱼雌雄时除了注意上述区别外, 还应注意斑马鱼 臀鳍和尾鳍的颜色, 一般说来雄斑马鱼的臀鳍和尾 鳍偏黄。 1. 2 生活习性
1. 1 形态特征 斑马鱼的体型呈纺锤形, 成鱼体长约 4) 6 cm,
体侧有与斑马类似的纵向银蓝色条纹, 背部为橄榄 色, 在臀鳍和尾鳍上也有与体侧相似的条纹。
收稿日期: 2010-06-03. 作者简介: 周寅 ( 1986-) , 男, 硕士研究生, E-m ai:l zhyyw fm@ 126. com. 通讯作者: 张红菱 ( 1965-) , 女, 教授, E-ma i:l zh lw jb@ s ina. com.
斑马鱼的繁殖和饲养技术
斑马鱼的繁殖和饲养技术1 斑马鱼斑马鱼（Zebra fish,Danio rerio）,又名蓝条鱼，花条鱼，斑马担尼。
斑马鱼，是淡水水族箱观赏鱼，原产于亚洲，体长约4公分，具暗蓝与银色纵条纹。
斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。
斑马鱼的雌雄不难区分：雄斑马鱼鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，鱼纹显著。
雌鱼鱼体教肥大，体色较淡，偏蓝，臀鳍呈淡黄色，胚卵期鱼腹膨大明显。
斑马鱼属卵生鱼类，4月龄进入成熟期，一般用5月龄繁殖较好。
2 斑马鱼饵料及其营养成分斑马鱼对饵料的要求不高，人工配合饵料及各种鲜活饵料均可。
但为保证斑马鱼较好的繁殖和生长，最好多种饵料结合投喂，人工饵料可以用软颗粒饲料或者全价硬颗粒饵料。
所用配合饵料的蛋白质含量要高于40%，粗脂肪高于3.5%，水分低于4%，钙、磷含量分别为0.9%-1.6%和0.8%-1.4%。
如果培育亲鱼，配合饵料中应添加一些促进性腺发育的元素，如Va、Vd、Ve以及微量元素锌、铁等。
在不同的发育时期选用鲜活饵料的种类不同。
在斑马鱼仔鱼阶段，可以投喂草履虫、轮虫、酵母等作为其开口饲料；在幼体阶段，可以投喂卤虫的无节幼体；随着斑马鱼的长大，饵料也变得丰富起来，可以投喂大型的浮游动物类以及桡（rao）足类，或者是蝇幼虫、摇蚊幼虫、水蚯蚓等，也可以投喂捣碎的小鱼小虾。
活体饵料对斑马鱼的性腺发育可以起到一定的促进作用，因此在亲鱼培育时，适量增加活体饵料会缩短其性腺发育周期。
3 斑马鱼的繁殖斑马鱼亲卵亲鱼的培育：斑马鱼在繁殖时通过光周期作用，在日出后产卵，为促进斑马鱼的成熟，我们在水族箱内按照雌雄1：2-1：3的比例放入斑马鱼，控制光周期为14：10（光照14h,黑暗10h），如有必要可以用黑布水族箱罩住，增加水体温度至28.5摄氏度，增加投喂次数，可以由原来的每天投喂2-3次增加为4次，并且增加鲜活饵料的投喂。
（1）自然产卵：斑马鱼一般10-12周可达到性成熟，但最好用17-18周的亲鱼进行大规模繁殖，斑马鱼为异体体外受精，繁殖周期短（一般7d左右），温度适合时一年四季都可产卵，卵量300-1000粒，为非粘性沉型卵。
斑马鱼模型在神经科学领域中广泛应用解析
斑马鱼模型在神经科学领域中广泛应用解析神经科学作为研究和探索大脑及其功能的学科，近年来取得了巨大的进展。
为了更好地理解大脑的复杂结构和功能，科学家们经常使用各种研究动物模型。
其中，斑马鱼模型因其生命周期短、透明度高、基因编辑相对容易等特点，成为了神经科学研究中的热门模型之一。
本文将对斑马鱼模型在神经科学领域中的广泛应用进行解析。
首先，斑马鱼模型在神经发育研究领域中得到了广泛应用。
斑马鱼胚胎发育迅猛，从受精卵到发育成熟的鱼类只需几天时间，这个过程中形成的神经系统可以直观地观察到。
研究者可以使用光学显微镜观察到神经元的形成和连接，从而研究神经发育的机制。
此外，斑马鱼的受精卵外包围着透明的卵黄，使得观察胚胎内部结构变得极为方便。
这为研究胚胎神经系统的形成和功能提供了独特的机会。
其次，斑马鱼模型在神经退行性疾病研究中也发挥着重要的作用。
许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等都与神经元的损伤和死亡有关。
斑马鱼作为脊椎动物模型，在解析这些疾病的机制和寻找潜在治疗方法上具有独特的优势。
研究者可以使用遗传学方法来诱导斑马鱼出现类似人类神经退行性疾病的症状，从而研究疾病的发病机制。
此外，斑马鱼也被广泛应用于药物筛选，通过观察药物对斑马鱼神经系统的影响，筛选出潜在的治疗方法。
另外，斑马鱼模型在神经活动研究领域也具有广泛的应用价值。
大脑的活动通过神经元之间的电信号传递来进行，研究大脑的电活动可以帮助我们理解其功能和信息处理机制。
斑马鱼的大脑结构相对简单，神经元数量相对较少，这使得研究者能够更好地观察和记录神经元的电活动。
同时，斑马鱼的大脑表面与观察者之间只隔着一个透明的头皮，可以通过荧光显微镜观察到神经元的活动。
这些特点使得斑马鱼模型成为研究神经活动的理想选择。
此外，斑马鱼模型在遗传学研究领域中也发挥着重要的作用。
斑马鱼基因组的测序工作早在2002年就已完成，目前有关斑马鱼基因的数据库非常丰富且不断更新。
科学家们可以通过基因编辑技术如CRISPR/Cas9等手段来研究和编辑斑马鱼基因，这使得研究者能够更好地理解基因对神经系统发育和功能的调控作用。
斑马鱼在生物学研究中的应用
斑马鱼在生物学研究中的应用斑马鱼是一种小型的热带淡水鱼类，因其身体上黑白相间的斑纹被称为斑马鱼。
在近年来，由于斑马鱼的短生命周期、大量繁殖和易于处理的特点，使其成为了生物学研究中非常重要的模式动物。
在本文中，我们将会探讨斑马鱼在生物学研究中的应用。
一、胚胎发育研究胚胎发育研究一直是重要的生物学研究领域，该领域的研究主要是探究胚胎形态生成及内部生理学过程。
斑马鱼在胚胎发育研究中是一种非常有用的动物模型，其从受精卵发展到成鱼只需要3-4个月的时间，相比其他脊椎动物更加迅速。
事实上，斑马鱼的受精卵在5小时内即可发育成胚胎，并在约24小时后发育出心脏、神经系统和胰腺等重要器官。
如此快速的发育周期为研究人员提供了充足的时间进行研究，并使得斑马鱼在胚胎发育研究中成为了最具有活力和便捷操作的动物模型之一。
二、遗传学研究遗传学是研究遗传物质传递和变异规律的科学，也是当今生物学研究的重要领域。
在遗传学研究中，斑马鱼被广泛用于研究基因功能以及基因突变等。
斑马鱼虽然拥有大量不同的基因序列，但与人类基因相似度高达70%，这意味着斑马鱼和人类拥有许多相同的基因。
由于斑马鱼在发育早期就能够进行带标签的基因转移，而且护理要求比其他动物低，所以斑马鱼被广泛用于研究基因突变所产生的变异表型。
三、药物筛选药物筛选是一个非常庞大而且繁难的过程，以确保所开发的药物在体内能够很好的发挥其治疗功能。
斑马鱼在药物筛选中起到了重要的作用。
由于斑马鱼有很高的代谢活性和药代动力学，可以帮助人们更好地理解药物的代谢途径以及药物的毒性，而这些信息对药物的开发和安全性非常重要。
此外，斑马鱼对于各种化学物质的反应能力也非常高，因此能够对潜在毒性进行全面、高效、廉价的筛选。
这使得斑马鱼成为了药物筛选中非常重要的模式生物之一。
四、神经科学研究神经科学是研究神经系统结构和功能的学科，斑马鱼也被应用到神经科学研究中。
斑马鱼在神经系统结构方面非常相似于人类，可以通过神经细胞的透明度进行实时的观察。
文献综述-斑马鱼及其应用
斑马鱼及其研究应用作者：杜颖指导老师：张源淑摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。
斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。
因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。
本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。
关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物Zebrafish and Its ApplicationAbstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarizedKey words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。
【初中生物】苏州大学利用TALEN技术研究斑马鱼生物钟
【初中生物】苏州大学利用TALEN技术研究斑马鱼生物钟2021年12月28日，苏州大学基础医学与生物科学学院王晗课题组，在国际著名学术期刊《journalofbiologicalchemistry》发表一项最新研究成果，题为“thezebrafishperiod2proteinpositivelyregulatesthecircadianclockthroughmediati onofrar-relatedorphanreceptoralpha(rorα)”。
在这项研究中，研究人员利用talen 技术，成功制备了两种斑马鱼per2无效突变体，阐明了per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为per2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据。
本文通讯作者为苏州大学基础医学与生物科学学院博士生导师、特聘教授王涵。
他毕业于安徽大学，获得中国科学院硕士学位和韦恩州立大学博士学位。
他自2022毕业于佐治亚医学院、俄勒冈大学和俄克拉何马大学的博士后研究和助理教授，曾担任医学院基础医学和生物科学学院的杰出教授。
苏州大学国家重大研究项目首席科学家。
主要研究方向包括生物钟的分子遗传学和基因组调控机制，生物钟对生殖和发育的影响，以及生物钟进化的分子遗传学和基因组机制。
他在自然遗传学、发展、进化和分子进化杂志等杂志上发表了40多篇学术论文。
生物钟，从生物对地球上光/暗周期长期和持久的适应进化而来，可以被当地环境因素（例如光、甚至食物）复位和同步，可以在大约24小时的一段时间内调节行为和生理学。
在几种生物（包括蓝藻、粗糙脉孢菌、黑腹果蝇和小鼠）中进行的一系列遗传和生化研究，已经确定了昼夜节律调控的分子遗传机制。
斑马鱼（daniorerio）是研究生物钟的极好模型。
它具有与果蝇和哺乳动物相似的昼夜节律调节成分。
光照和温度是斑马鱼生物钟的关键诱因。
特别是斑马鱼的外周组织可以直接对光信号做出反应并产生节奏。
两个光受体（tmt视蛋白和opsin4.1），已被证明对于斑马鱼外周生物钟的光夹带至关重要。
斑马鱼在发育生物学中的应用
斑马鱼在发育生物学中的应用作为一种小型、容易繁殖和生命周期短的鱼类，斑马鱼越来越被广泛应用于不同领域的研究中，尤其是在发育生物学中的应用越来越受到重视。
本文将从斑马鱼的发育特点、基因篡改技术以及在生物医学和药物研究中的应用等方面进行探讨。
一、斑马鱼的发育特点斑马鱼在人类疾病模型建立、药物筛选等研究中被广泛使用，其主要原因是该种鱼对外界环境的敏感性高，且其胚胎发育过程与人类相似。
斑马鱼的生长速度较快，从受精卵到成年仅需3个月左右。
同时，斑马鱼的生殖能力也很强，每对成年斑马鱼每天能产生1000个卵子以上。
这使得研究人员在斑马鱼身上进行大量实验成为可能。
此外，斑马鱼也具有一些特殊的发育特点，如胚胎的透明度和快速发育过程，使得观察其发育过程更加容易。
此外，在分子生物学技术方面，斑马鱼的基因组已经被完整测序，且其基因组大小与人类相似，这意味着斑马鱼可以作为人类基因的模型研究。
二、基因篡改技术在斑马鱼的研究中，基因篡改技术是一项必不可少的技术，这些技术能够使研究人员将特定的基因进行特定的修改，从而调控其在斑马鱼生长发育过程中的表达。
基因转录研究中，两个特定的基因一旦发生拼接错误，往往会导致人类疾病的发生。
通过基因篡改技术可以模拟这些基因的突变，并进一步了解其发育过程的细节。
同时，基因篡改技术也能够将人类基因表达到斑马鱼体内，使得斑马鱼成为人类基因表达的一个模型。
目前，有两种主要的基因篡改技术被广泛使用。
一种技术是利用ZOETI 或CRISPR-Cas9系统进行基因修饰，另一种则是通过转基因鱼、或者利用微注射等技术来实现基因篡改。
三、斑马鱼在生物医学和药物研究中的应用1. 斑马鱼在药物研究中的应用斑马鱼在药物研究中可以扮演重要角色。
其快速发育和繁殖的特点，使得微观变化较容易观察，更重要的是，斑马鱼的发育过程在各方面与人体极其相似，因此用斑马鱼进行动物实验相对于小鼠等动物而言更加便捷。
例如，研究者可以利用斑马鱼从多个维度验证某一特定类药物的有效性和安全性。
斑马鱼的培养及TALENs技术的应用
预习实验报告：实验二斑马鱼的培养及TALENs技术的应用一．实验背景和目的基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
在现代生物医药领域中，基因敲除技术应用越来越广泛，主要体现在以下五个方面：①．建立生物模型，在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要，基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究；②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗，通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响，这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。
③.提供廉价的异种移植器官，众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体，这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。
如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT 基因。
使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的基因的２个拷贝。
这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。
在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生[10]。
④. 免疫学中的应用，同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。
而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。
斑马鱼在生命科学研究领域中的应用
斑马鱼在生命科学研究领域中的应用斑马鱼（Danio rerio）是一种小型热带淡水鱼类，因其身上具有黑白相间的斑纹而得名。
斑马鱼在生命科学研究领域中广泛应用，尤其在遗传学、发育生物学、神经科学以及药物筛选等研究领域具有重要的地位。
本文将重点介绍斑马鱼在这些研究领域中的应用，并探讨其优势和前景。
其次，斑马鱼在发育生物学研究中具有独特优势。
斑马鱼的胚胎发育十分迅速，从受精到成鱼只需2-3个月时间。
在这个过程中，斑马鱼的胚胎透明，可以高分辨率观察到内脏器官以及运动和心血管系统的发育过程。
此外，斑马鱼胚胎的体型小，可容纳在96孔板中高通量筛选药物。
通过荧光标记技术，可以标记到特定基因的表达，并观察其对发育的影响。
这些特点使斑马鱼成为研究发育生物学和胚胎发育的极具价值的模式生物。
斑马鱼在神经科学研究中也扮演了重要角色。
斑马鱼的中枢神经系统相对简单，但结构与人类相似，有助于研究神经系统的发育和功能。
斑马鱼胚胎的神经元可通过荧光标记示踪，观察神经元的迁移和分化过程。
此外，斑马鱼突变体和转基因模型可用于研究神经发育缺陷和神经退行性疾病，如癫痫和帕金森病。
斑马鱼的神经系统透明和早期的动物和行为行为，也使其成为研究光遗传学和光控制神经元活动的理想模型。
此外，斑马鱼在药物筛选和毒理学研究中也具有潜力。
由于斑马鱼胚胎的透明性和发展速度快，可以用于高通量筛选药物和毒素。
药物或化合物可以直接添加到网格中的孔中，观察其对斑马鱼胚胎发育和行为的影响。
通过这种方法，可以发现新的药物或治疗方法，也可以评估化学物质的安全性和毒性。
总之，斑马鱼在生命科学研究领域中具有独特的优势和广泛的应用。
其快速的繁殖周期、透明度和相对简单的神经系统使其成为遗传学、发育生物学、神经科学和药物筛选等研究领域的理想模式生物。
斑马鱼的研究为人类疾病的治疗和新药开发提供了重要的线索，同时也为我们更好地理解生命的奥秘和自身的发展过程提供了极为便利的途径。
斑马鱼的研究前景广阔，相信在未来的科学研究中将继续发挥重要作用。
斑马鱼的生物学特性及其在神经科学研究中的应用
斑马鱼的生物学特性及其在神经科学研究中的应用斑马鱼是一种小型淡水鱼类，体型通常只有2-3厘米。
它们生活在印度次大陆和缅甸的河流和池塘中。
在近年来的生物医学研究中，斑马鱼因其短的生命周期和易于观察的透明胚胎而成为一种广泛使用的模型生物。
一、斑马鱼的生物学特性1.1 发育特性斑马鱼的短的生命周期和透明的胚胎使得研究者可以直观的观察胚胎发育过程中各个阶段的变化。
斑马鱼的胚胎发育非常快，从受精卵到孵化只需1-2天。
在此期间，斑马鱼的胚胎会经历各种组织和器官的形成过程。
这种特性使得斑马鱼成为了研究胚胎发育及其异常的理想模型生物。
1.2 遗传学特性斑马鱼的遗传学特性非常引人注目。
斑马鱼是一种两性染色体系统，它们的基因组非常小，只有大约1.5亿个碱基对。
这种特性使得研究者可以用相对较小的代价鉴定斑马鱼的遗传突变。
斑马鱼也拥有非常复杂的行为模式和大量的内部器官，这些器官可以用来考察与遗传学相关的行为和生理学问题。
1.3 神经元特性斑马鱼的神经构造也非常显著。
它们的背脊神经干非常容易观察，而且它们的神经元数量相对较少，紧密排列在一起，这使得跨神经元的信号传递可以被跟踪和解析。
此外，斑马鱼的大脑区域也比较小，这使得研究者可以研究神经元和突触的形成和肆意扩散。
二、斑马鱼在神经科学研究中的应用2.1 神经退化问题随着人口老龄化的到来，神经退化性疾病成为了一个非常重要的研究领域。
研究者通过斑马鱼模型研究神经细胞的退化机制，发现了大量的关于蛋白质聚合物构造和神经保护的重要信息。
这些发现对于神经退化性疾病的治愈和预防带来了新的思路和展望。
2.2 神经条形图谱的制作神经条形图谱（neural circuit map）是描述神经元之间连接和信号传递的一种图表。
由于斑马鱼胚胎的生物特性，研究者可以轻松观察和记录斑马鱼胚胎中神经元的形成和排列情况，包括神经元周边环境、质量和数量等信息。
这些信息可以是制作神经条形图谱的重要组成。
2.3 行为学研究斑马鱼是一种有信号接收和反应行为的动物。
饲养斑马鱼的方法
饲养斑马鱼的方法斑马鱼在水族馆里非常有名，那斑马鱼怎么饲养呢？下面一起来看看店铺为大家精心推荐的斑马鱼的饲养方法，希望能够对您有所帮助。
斑马鱼的饲养方法斑马鱼又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度斑马鱼，为辐鳍鱼纲鲤形目鲤科的其中一种。
斑马鱼身体延长而略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，全身布满多条深蓝色纵纹似斑马，与银白色或金黄色纵纹相间排列。
在水族箱内成群游动时犹如奔驰于非洲草原的斑马群，故此得斑马鱼之美称。
斑马鱼和人类基因有着87%的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，可用于水质环境的监测。
斑马鱼的生长繁殖斑马鱼属卵生鱼类，4月龄进入性成熟期，一般用5月龄鱼繁殖较好。
繁殖用水要求pH6.5-7.5,硬度6-8，水温25-26摄氏度。
喜在水族箱底部产卵，斑马鱼最喜欢自食其卵，一般可选6月龄的亲鱼，在25厘米X25厘米X25厘米的方形缸底铺一层尼龙网板，或铺些鹅卵石，繁殖时产出后即落入网板下面或散落在小卵石的空隙中。
选取2~3对亲鱼，同时放入繁殖缸中，一般在黎明到第二天上午10时左右产卵结束，亲鱼捞出。
其卵无粘性，直接落入缸底，到晚上10时左右，没有受精的鱼卵发白，可用吸管吸出。
繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼;水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼。
雌鱼每次产卵300余枚，最多可达上千枚。
水温25℃时，7~8天的仔鱼开食，此时投喂蛋黄灰水，以后再投喂小鱼虫。
斑马鱼的繁殖周期约7天左右，一年可连续繁殖6-7次，而且产卵量高。
其繁殖力很强，是初学饲养热带鱼的首选品种。
斑马鱼的人工繁殖斑马鱼是属於卵生鱼类，4月龄进入性成熟期，一般是选择做用5月龄鱼来作亲鱼再加上鱼只应该是身强体壮，以进行繁殖比较好。
斑马鱼的繁殖周期约7天左右，一年可连续繁殖6-7次，而且产卵量高。
其繁殖力很强，是初学饲养热带鱼的首选品种。
一、雌雄鱼体鉴别斑马鱼的雌雄不难区分：雄斑马鱼鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，条纹显着;雌鱼鱼体较肥大，体色较淡，偏蓝，臀鳍呈淡黄色，怀卵期鱼腹膨大明显。
斑马鱼模型在生物学研究中的应用
斑马鱼模型在生物学研究中的应用斑马鱼，又称斑马仔鱼，是一种常见的热带淡水鱼。
它的体形小巧、生长迅速、繁殖能力强，因此被广泛用于生物学实验室。
斑马鱼作为模型生物，在不同领域的研究中功不可没。
本文将介绍斑马鱼模型在生物学研究中的应用，并探讨其优点和局限性。
1、发育生物学斑马鱼发育期短，且透明度高，使得观察斑马鱼的胚胎发育成为可能。
通过显微注射技术和转基因技术，生物学家可以在胚胎中注射不同的荧光蛋白，用于研究特定基因的表达及其在发育中的作用。
同时，斑马鱼胚胎可用于药物筛选和毒理学研究，这些研究有助于了解人类疾病的发生和治疗方法的开发。
2、神经生物学斑马鱼的神经系统与哺乳动物的神经系统类似，但是神经元数量相对较少，神经回路相对简单，是研究神经系统初步机制的理想模型。
近年来，生物学家利用光遗传学方法在斑马鱼体内操纵特定神经元的活动，从而揭示了许多基本的神经生物学机制。
3、遗传学研究斑马鱼基因组经过测序，目前已知其基因数约为2.5万个，与人类有许多保守的基因。
斑马鱼基因组的完整性以及易于基因编辑和注射的特点，使其成为遗传学研究的重要对象。
近几年来，斑马鱼模型的基因敲除、基因添加和基因编辑等技术得到了极大的发展，研究人员可以利用这些技术在斑马鱼体内模拟人类遗传病，从而寻找治疗方法并研究疾病的发生机制。
斑马鱼模型的应用具有明显的优点，但也存在局限性。
首先，斑马鱼与人类的差异性较大，部分生物学机制可能无法溯源到人类。
其次，斑马鱼的模型不利于研究长期进展的疾病。
此外，利用斑马鱼模型进行药物筛选时，斑马鱼体内的代谢与人类不同，因此结果可能不具有可靠性。
总体而言，斑马鱼作为模型生物，在生物学研究中具有重要的应用价值。
然而，利用斑马鱼模型进行研究时应该充分考虑其优点和局限性，并将其结果与其他模型的结果相互参照。
未来，斑马鱼模型在生物学研究中的应用将会更加广泛。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是一种重要的生物技术手段，通过改变生物体的基因组，可以为人类提供很多益处。
斑马鱼作为一种常用的实验动物模型，其胚胎养殖技巧对于转基因研究具有重要意义。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖的技巧，包括胚胎收集、胚胎培养和胚胎转染等方面。
一、胚胎收集在进行转基因斑马鱼胚胎养殖之前，首先需要从成年斑马鱼体内收集受精卵和早期胚胎。
收集受精卵的方法可以通过自然产卵或人工授精来实现。
自然产卵时，将雌雄斑马鱼放入产卵器中，提供适宜的环境条件，如温度和水质等，等待斑马鱼自行产卵。
人工授精时，将雄性斑马鱼和雌性斑马鱼分别收集到不同的容器中，然后用玻璃棒轻轻按压雄性斑马鱼的腹部，使其释放精子，再将精子加入雌性斑马鱼容器中进行授精。
收集到的受精卵可以放置在含有适宜培养液的培养皿中，继续进行后续的胚胎培养。
二、胚胎培养胚胎培养是转基因斑马鱼胚胎养殖的重要环节。
在胚胎培养过程中，需要控制适宜的温度、光照和培养液等因素，以促进斑马鱼胚胎的正常发育。
通常情况下，将受精卵或早期胚胎转移到含有适宜培养液的培养皿中，然后放置在恒温箱中进行孵化。
在孵化过程中，可以根据需要，调整温度和光照条件，以模拟自然环境。
此外，还可以添加适量的抗生素和抗菌剂，以防止细菌和真菌的污染。
胚胎培养的时间可以根据实验需要进行调整，通常为24小时至72小时不等。
三、胚胎转染胚胎转染是转基因斑马鱼胚胎养殖的关键步骤，通过该步骤可以将外源基因导入斑马鱼胚胎中，实现基因的转移和表达。
常用的转染方法包括注射法和电穿孔法。
注射法是将含有目标基因的DNA溶液注射到斑马鱼胚胎的细胞中，通常选取胚胎早期发育阶段进行注射，以确保外源基因的有效转染。
电穿孔法是通过应用电脉冲来增加细胞膜的通透性，使得外源基因能够更容易地进入斑马鱼胚胎细胞中。
无论采用哪种方法，转染后的斑马鱼胚胎需要经过进一步培养和筛选，才能确定是否成功转染和表达。
结论：转基因斑马鱼胚胎养殖技巧是进行转基因研究的重要环节。
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“斑马鱼的培养及TALENs技术的应用”预习报告一、实验原理1、TALENs实验技术原理类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶, 它由特异性的 TALE DNA 结合结构域和非特异性的 FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。
TALEN 能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成 DNA 双链断裂, 从而诱导该靶序列产生 indel突变。
2、斑马鱼的生活习性以及作为模式生物的优势斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼），成年鱼全身仅长4－5厘米，因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。
斑马鱼很容易在实验室饲养，一般3个月就可以达到生殖成熟期，雌鱼每次产卵200枚左右，一生可产卵数千枚，斑马鱼所产之卵经24小时即可胚胎发育成熟，仔鱼期只有1个月。
更独特的是，斑马鱼的卵是透明的，整个胚胎发育在体外完成，也是透明的。
优势：显著优势在于体积小( 3cm～4 cm)，可在较小的空间大量繁殖；产卵量高(每周200多个)；发育快，许多组织在受精后24 h开始形成；成熟周期短；体外受精且胚胎透明，可在体视解剖镜下观察；单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易；精子可以冷冻保存。
所有这些特点都使斑马鱼非常适合于遗传学的研究。
斑马鱼的基因组中大约含有30000个基因，这个数目与人类差不多，而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。
它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在分子水平上85%与人相同。
二、实验目的通过本实验可以了解TALENs实验技术的基本原理，熟悉其几个关键实验步骤的操作，学习显微注射技术，从而能够独立应用这些技术进行相关学术研究。
三、实验器材1、实验仪器超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex) 、 NanoDrop(ND-1000 Spectro pho tometer)、PCR 仪，体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机 1.3.2 耗材细菌培养皿、移液枪、移液枪枪头、Eppendorf 离心管、PCR 管、显微操作仪，倒置显微镜，拉针仪，胶头滴管，胶固定板。
2、实验试剂NEB 限制性内切酶：BstNI-HF、KpnⅠ、NheⅠ-HF、NotⅠ-HF 或 SacⅡ、SpeⅠ-HF。
试剂盒：DNA 连接试剂盒(TaKaRa, D6020)、微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、快速 DNA 产物纯化试剂盒、SP6mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion, AM1340)(用于体外转录 TALEN mRNA)、T 载体试剂盒(pMD®18-T,TaKaRa, D101A) 琼脂糖、DNA marker、1×TAE、氨苄青霉素、 LB 琼脂培养基、LB 液体培养基、2×Taq MasterMix (含染料)、碱性磷酸酶(CIAP,TaKaRa, D2250)、1 mol/L Tris(pH 8.0)、50 mmol/L NaOH、70%乙醇、超纯水(ddH2O, 18 MΩ)，酚红3、实验材料大肠杆菌，斑马鱼胚胎，TALE单体质粒系列，pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列四、实验步骤1、TALE片段的设计（参考基因：HSF4）https:///files/filenLMQK0.txt【示例 1】斑马鱼基因HSF4 TALEN 靶点信息基因名左半位点长度(bp) Spacer 长度(bp) Spacer 中的内切酶右半位点长度(bp)Hsf41815BstNI(CCWGG) 19(加下划线) (加下划线)5′-t GCACGCGCGTCCCCGCTG cccaacgaagcctgg GTCGCGTTGCGCCGCCGCC a-3′3′-a CGTGCGCGCAGGGGCGAC gggttgcttcggacc CAGCGCAACGCGGCGGCGGt-5′2、TALEN片段的克隆（写出详细的操作步骤）2.1酶切（第一次）（质粒的结构、种类、酶切体系、过程等）1）向离心管中加入组装好的 TALE 重复序列载体 pMD-TALE，用 SpeⅠ和 NheⅠ双酶切；向离心管中加入 pCS2-T-PEAS载体，用 NheⅠ分别单酶切。
1．新提的质粒，在10uL的体系中进行处理，即：体系I 体系II10μL 0 TALE 重复序列载体pMD-TALEpCS2-T-PEAS载体0 5μL 10×缓冲液2μL 1μLSpeⅠ1μL 0NheⅠ 1μL 1μL6μL 3μLddH2O2．37℃，保温2-3h。
3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。
各酶解样品于冰箱中贮存备用。
2.2琼脂糖电泳（1）琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。
（2）胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。
取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。
注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。
将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
(3)加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。
加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。
(4)电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。
在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。
(5)染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。
染色20min后，用大量水冲洗。
2.3割胶回收（试剂盒名字、过程）名字：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）过程：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
(1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）(2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
(3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN 完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。
(4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。
(5）向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW 加入后静置2-5 min再离心。
(6）重复操作步骤5。
(7）将吸附柱CA2放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，尽量除尽漂洗液。
将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
(8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。
12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min收集DNA溶液。
注意：洗脱体积不应小于30 μl，体积过少影响回收效率。
洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。
若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH 值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
DNA也可以用缓冲液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脱。
为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。
2.4酶连（体系的设计、操作过程）（1）pCS2载体骨架CIAP去磷酸化, 快速DNA产物纯化试剂盒回收后备用（2）将上述去磷酸化的pCS2载体骨架与双酶切后回收的 TALE 重复序列片段混合，加入连接酶连接2.5转化（操作过程及对照组实验设计）(一)大肠杆菌感受态细胞的制备1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。
将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。
2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。
3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。
4．于4℃，5000rpm离心10min。
5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。