关于免疫学检测方法课件
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医学免疫学免疫学检测技术ppt课件
14
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
双抗体夹心法、间接法ELISA
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间接法ELISA
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ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
免疫检验课件ppt
移植免疫监测
器官移植后，患者需要接受免疫抑制治疗以防止排斥反应。通过监测免疫功能和相关抗体，有助于评估患者的免疫状态和移植效果。
02
CHAPTER
免疫检验基础知识
抗原是指能够刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答的物质，包括外源性抗原和内源性抗原。
抗原
抗体是指机体在抗原刺激下产生的具有高度特异性的蛋白质分子，能够与相应抗原结合，发挥免疫效应。
通过检测T细胞增殖和转化能力，评估机体的细胞免疫功能。
通过检测细胞因子表达水平，了解机体的免疫应答状态。
通过检测免疫细胞的杀伤、吞噬、释放细胞因子等功能，评估机体的免疫功能。
利用基因芯片等技术对免疫相关基因的表达水平进行检测，了解机体的免疫应答机制。
基因表达谱分析
通过制备针对特定抗原的单克隆抗体，用于免疫学检测和免疫治疗。
通过检测炎症因子（如IL-1、IL-6、TNF等）的水平，了解机体的炎症反应状态。
通过检测自身抗体（如类风湿因子、抗核抗体等）的水平，了解机体的自身免疫状态。
04
CHAPTER
常见免疫检验项目及解读
总结词
乙肝两对半检测是常见的免疫检验项目之一，用于检测乙型肝炎病毒的抗原和抗体。
详细描述
乙肝两对半检测包括乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）和核心抗体（HBcAb）的检测。通过检测这些抗原和抗体，可以了解个体是否感染了乙型肝炎病毒，以及感染阶段和免疫状态。
01
免疫组学技术
利用免疫组学方法，研究免疫细胞和分子的功能和相互作用，为免疫疾病的诊断和治疗提供新思路。
02
生物信息学
结合生物信息学技术，对免疫相关基因和蛋白质进行大数据分析，挖掘免疫相关疾病的发病机制和潜在治疗靶点。
免疫检测法PPT课件
质。
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
免疫学检测技术(课堂PPT)
.
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一、凝聚反应(Agglutination)
二、沉淀反应
1、溶液中的沉淀反应
2、凝胶扩散沉淀
3、免疫电泳Biblioteka 血清免疫电泳火箭电泳
对流免疫电泳
三、补体参与的反应
四、免疫标记的抗原抗体技术
酶联免疫吸附（ELISA）
.
37
一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原，抗体称为凝集素。
. Equivalence – Lattice formatio6 n
抗原或抗体检测原理
.
7
• 免疫学（Immunology）：
是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应 答的规律及免疫应答的调节的一门科学。
• 免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识 别自我与非自我的过程。排除异己，维护 自身稳定的生理反应。
体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使
细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些
细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下
或失调时，会导致肿瘤或癌. 症。
9
抗原 （Antigen）
抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，
并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生 反应的物质。
亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。
自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体 蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白
2. 大分子胶体：一般在10 kD以上 。
3. 具有复杂的立体结构或空间构象.
如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差。
《免疫学检查》ppt课件
6
标记
7
第一节 免疫球蛋白〔Ig〕的检测
8
❖Ig的产生、构造与功能 Ig通常是指具有抗体活性和〔或〕抗
体样构造的球蛋白，由浆细胞产生，有特 异性识别抗原的功能，但必须与抗原结合 形成免疫复合物后才能启动效应功能。 ❖包括：IgG、A、M、D、E
9
一、IgG
+ 参考值：7.0-16.6g/L, 占70-80％ + 特点：长效、能透过胎盘，抗菌、抗病毒 + 测定方法：单向免疫扩散〔手工〕
1.E花环〔RFC〕 原理：T细胞外表具SRBC受体 正常 58-72％左右
2.淋巴细胞转化试验〔LCT〕 原理：淋T PHA 淋母细胞 正常：同上 意义：T细胞数量↓免疫缺陷、肿瘤、免疫病
20
3．淋巴细胞分化抗原测定
T细胞：CD3-总T标志 CD4-TH标志 CD8-Ts标志
B细胞： CD19、CD20、CD22等 细胞的荧光免疫标记技术 流式细胞仪的应用
3.CA153〔癌抗原153〕－－对乳腺癌有重要
的辅助诊断作用
28
肿瘤标志物的临床应用
1 筛查：高危人群 2 诊断、良/恶鉴别：辅助指标 3 疗效观察：外科—手术切除/残瘤/姑息
保守—药效、放疗效果 4 预后：病员分群,标志物: 5 随访……
29
第五节 自身抗体检测 〔P423〕
--自身免疫病是指免疫系统对自身成 分的免疫耐受性减低或破坏，产生 自身抗体损伤含有相应自身抗原的 组织器官而造成的疾病。
感染、多克隆增高 ↓反复呼吸道感染 非IgA单克隆，如SLE、
免疫缺陷等
11
三、IgM
+ 参考值：0.5-2.6g/L,占5-10％ + 特点：五聚体，大分子
标记
7
第一节 免疫球蛋白〔Ig〕的检测
8
❖Ig的产生、构造与功能 Ig通常是指具有抗体活性和〔或〕抗
体样构造的球蛋白，由浆细胞产生，有特 异性识别抗原的功能，但必须与抗原结合 形成免疫复合物后才能启动效应功能。 ❖包括：IgG、A、M、D、E
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一、IgG
+ 参考值：7.0-16.6g/L, 占70-80％ + 特点：长效、能透过胎盘，抗菌、抗病毒 + 测定方法：单向免疫扩散〔手工〕
1.E花环〔RFC〕 原理：T细胞外表具SRBC受体 正常 58-72％左右
2.淋巴细胞转化试验〔LCT〕 原理：淋T PHA 淋母细胞 正常：同上 意义：T细胞数量↓免疫缺陷、肿瘤、免疫病
20
3．淋巴细胞分化抗原测定
T细胞：CD3-总T标志 CD4-TH标志 CD8-Ts标志
B细胞： CD19、CD20、CD22等 细胞的荧光免疫标记技术 流式细胞仪的应用
3.CA153〔癌抗原153〕－－对乳腺癌有重要
的辅助诊断作用
28
肿瘤标志物的临床应用
1 筛查：高危人群 2 诊断、良/恶鉴别：辅助指标 3 疗效观察：外科—手术切除/残瘤/姑息
保守—药效、放疗效果 4 预后：病员分群,标志物: 5 随访……
29
第五节 自身抗体检测 〔P423〕
--自身免疫病是指免疫系统对自身成 分的免疫耐受性减低或破坏，产生 自身抗体损伤含有相应自身抗原的 组织器官而造成的疾病。
感染、多克隆增高 ↓反复呼吸道感染 非IgA单克隆，如SLE、
免疫缺陷等
11
三、IgM
+ 参考值：0.5-2.6g/L,占5-10％ + 特点：五聚体，大分子
临床常用免疫学检测PPT课件
四、降钙素原检测
严重全身性细菌感染时升高 动态监测可评估治疗效果
五、特异性IgE检测
介绍了临床常用免疫学检测项目的临床意义及应用，检测方法及参考范围，各 临床免疫学检测项目的特点。
谢谢您的观看！
CA125存在于卵巢癌组织细胞和浆液性腺癌组织中，不存在于黏液型卵巢癌中。
（五）癌抗原242测定 （六）癌抗原153测定
乳腺癌时，30％～50％的病人可见CA153明显升高，但在早期乳腺癌时，它的阳性率仅 为20%～30%左右，因此主要用于乳腺癌病人的治疗监测和预后判断。
诊断学（第9版）
三、酶类肿瘤标志物检测
（一）前列腺酸性磷酸酶测定 （二）神经元特异性烯醇化酶测定
诊断学（第9版）
降钙素
四、激素类肿瘤标志物检测
甲状腺滤泡细胞C细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，甲状腺髓样癌病人血清降钙素 明显升高，而且由于降钙素的半减期较短，因此可作为观察临床疗效的标志物。
第四节
自身抗体检测
诊断学（第9版）
一、类风湿因子的检测
一、蛋白质类肿瘤标志物的检测
（一）甲胎蛋白测定
胎儿早期由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，出生后，AFP的合成很快受到抑制。
1.原发性肝癌病人血清中AFP的含量明显升高，常>300μg/L 2.病毒性肝炎与肝硬化病人血清中AFP有不同程度的升高，但常300μg/L 3.生殖腺胚胎肿瘤病人血清中AFP可升高 4.妊娠3～4个月，孕妇AFP开始升高，7～8个月达高峰，但多低于400μg/L，分 娩后3周恢复正常
第八章
临床常用免疫学检测
第一节 体液免疫检测 第二节 细胞免疫检测 第三节 肿瘤免疫检测 第四节 自身免疫检测 第五节 感染免疫检测 第六节 抑制免疫检测 第七节 其他免疫检测
严重全身性细菌感染时升高 动态监测可评估治疗效果
五、特异性IgE检测
介绍了临床常用免疫学检测项目的临床意义及应用，检测方法及参考范围，各 临床免疫学检测项目的特点。
谢谢您的观看！
CA125存在于卵巢癌组织细胞和浆液性腺癌组织中，不存在于黏液型卵巢癌中。
（五）癌抗原242测定 （六）癌抗原153测定
乳腺癌时，30％～50％的病人可见CA153明显升高，但在早期乳腺癌时，它的阳性率仅 为20%～30%左右，因此主要用于乳腺癌病人的治疗监测和预后判断。
诊断学（第9版）
三、酶类肿瘤标志物检测
（一）前列腺酸性磷酸酶测定 （二）神经元特异性烯醇化酶测定
诊断学（第9版）
降钙素
四、激素类肿瘤标志物检测
甲状腺滤泡细胞C细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，甲状腺髓样癌病人血清降钙素 明显升高，而且由于降钙素的半减期较短，因此可作为观察临床疗效的标志物。
第四节
自身抗体检测
诊断学（第9版）
一、类风湿因子的检测
一、蛋白质类肿瘤标志物的检测
（一）甲胎蛋白测定
胎儿早期由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，出生后，AFP的合成很快受到抑制。
1.原发性肝癌病人血清中AFP的含量明显升高，常>300μg/L 2.病毒性肝炎与肝硬化病人血清中AFP有不同程度的升高，但常300μg/L 3.生殖腺胚胎肿瘤病人血清中AFP可升高 4.妊娠3～4个月，孕妇AFP开始升高，7～8个月达高峰，但多低于400μg/L，分 娩后3周恢复正常
第八章
临床常用免疫学检测
第一节 体液免疫检测 第二节 细胞免疫检测 第三节 肿瘤免疫检测 第四节 自身免疫检测 第五节 感染免疫检测 第六节 抑制免疫检测 第七节 其他免疫检测
临床常用免疫学检验方法PPT(21张)
•
3、大概是没有了当初那种毫无顾虑的勇气，才变成现在所谓成熟稳重的样子。
•
4、世界上只有想不通的人，没有走不通的路。将帅的坚强意志，就像城市主要街道汇集点上的方尖碑一样，在军事艺术中占有十分突出的地位。
•
5、世上最美好的事是：我已经长大，父母还未老;我有能力报答，父母仍然健康。
•
6、没什么可怕的，大家都一样，在试探中不断前行。
糖脂类P460-461
癌抗原50（cancer antigen 50, CA-50) 癌抗原72-4（cancer antigen 72-4, CA72-4) 糖链抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9,
CA19-9) 癌抗原242（carbohydrate antigen 242, CA242)
临床常用免疫学检
验
西南医院检验 科
府伟 灵
要 求 了解常用免疫学检验方法
熟练掌握常用免疫学指标的临床意义
能根据诊断需要准确选用免疫学指标
能准确解读临床免疫学检验报告
免疫学检验技 免疫沉术淀技术
免疫电泳技术 酶联免疫测定 放射免疫分析 化学发光免疫测定 其他免疫细胞活性与数量测定技术
免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM 免疫比浊法
IgE
IgE
免疫发光
血清补体检测
P442-443
缺乏特异性诊断意义，主要用于 机体体液免疫功能状态的评估。
临床检验现状：
感染性疾病的免疫学诊断
在《临床病原体检查》 中讲述。
肿瘤标志物检测
P458-462
肿瘤标志物（tumor marker)：P458
在肿瘤发生、发展过程中，由肿瘤细 胞合成、释放的物质或由机体对肿瘤发 生反应而产生的一类物质；与正常组织 相比，这些物质在机体内的含量显著增 高；检测这些物质可以反映肿瘤的恶变 阶段和肿瘤的基因型。
免疫学检测技术PPT课件
单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
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细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
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不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
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化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
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第三节 免疫细胞功能的检测
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免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
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(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
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应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
免疫学检测技术课件
内容
掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结 合力和比例。
掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、 二抗的选择与使用。
掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法。 掌握免疫印痕（Western blot）的技术原理与方法。 了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法。 目标：
掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法
• 带现象（zone phenomenon）：等价带前后 分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成。
• 前带（prezone）：抗体过量
• 后带（postzone）：抗原过剩。
2/16/2021
免疫学检测技术
15
抗原抗体比例对反应现象的影响
2/16/2021
免疫学检测技术
16
3、可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应。
体超变区分子间的互补性和亲和性。
2/16/2021
免疫学检测技术
7
2/16/2021
免疫学检测技术
8
互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变 区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。
亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗 原表位间互相适应产生的吸引力。
互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab 间固有的作用力。
抗原抗体间的作用力有：
2/16/2021
免疫学检测技术
10
抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以 下几种：
1、盐键（离子键） 2、范德华力 3、疏水作用 4、氢键
2/16/2021
免疫学检测技术
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3、亲水胶转化为疏水胶
抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。 一旦破坏电荷和水化层，如Ag + Ab，减少电荷， 由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag –Ab复 合物沉淀。
掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结 合力和比例。
掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、 二抗的选择与使用。
掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法。 掌握免疫印痕（Western blot）的技术原理与方法。 了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法。 目标：
掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法
• 带现象（zone phenomenon）：等价带前后 分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成。
• 前带（prezone）：抗体过量
• 后带（postzone）：抗原过剩。
2/16/2021
免疫学检测技术
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抗原抗体比例对反应现象的影响
2/16/2021
免疫学检测技术
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3、可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应。
体超变区分子间的互补性和亲和性。
2/16/2021
免疫学检测技术
7
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免疫学检测技术
8
互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变 区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。
亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗 原表位间互相适应产生的吸引力。
互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab 间固有的作用力。
抗原抗体间的作用力有：
2/16/2021
免疫学检测技术
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抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以 下几种：
1、盐键（离子键） 2、范德华力 3、疏水作用 4、氢键
2/16/2021
免疫学检测技术
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3、亲水胶转化为疏水胶
抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。 一旦破坏电荷和水化层，如Ag + Ab，减少电荷， 由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag –Ab复 合物沉淀。
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当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或 粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原 抗体结合处为黑褐色的颗粒。
斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用 与研究进展
是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和 HIV等。
沉淀凝集反应
双向免疫扩散沉淀线示意图
琼扩反应
中和实验
荧光免疫技术
荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫 化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术 的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学 及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的 、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛 应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相 应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原 、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的 研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等 方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏 感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解 决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复 杂。
与阴性对照的值），判定ELISA反应结果。大于2.1时可判断为阳性。 以最大显色至阳性的显色孔50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。
图 DOT BLOT方法筛选结果图。
免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布
细胞免疫化学法检测病毒感染
四、Western blot
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 。 原理及步骤 样品
关于免疫学检测方法
检测技术种类
一、免疫学检测
免疫凝集试验 免疫沉淀试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 免疫印迹试验
细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应 中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价
1.稀释抗体
管号 磷酸盐缓冲液
斑点免疫金渗滤法原理：
NCM为固相载体-----通过渗滤----抗原与抗 体在膜上快速反应-----标记的胶体金堆积显 色。
胶体金
吸水垫
抗原
抗体
NCM
临床应用： ❖ 间接法测抗体：
NCM 抗原----样品抗体----金标抗抗体显
色
❖ 夹心法测抗原：ຫໍສະໝຸດ NCM多抗----样品抗原----金标单抗显色。
聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （SDS-PAGE )
转移（印迹）于硝酸纤维素膜
加抗体检测某种特异性蛋白质
West Blot
图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果
免疫电镜技术
免疫电镜技术（immune electron microscopic technique） 是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方 法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞 水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一 技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子 水平。主要有以下几种技术。
➢ 铁蛋白抗体法 ➢ 酶标记抗体法 ➢ 重金属标记抗体法
图 胶体金标记免疫电镜结果[(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm]
胶体金免疫技术
胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能 与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所 有的大分子物质都可被金标记，而且标记后 大分子物质活性不发生改变。
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1.0
兔抗X菌血清
0.1 0.1(1 0.1(
)
2)
0.1( 3)
0.1( 4)
0.1(5 0.0 )
2.玻片凝集法
A.用1ml移液枪取6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴 磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的X菌液。
B.牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。 C.后取5、4……1号管的溶液逐个重复1、2步骤。 D.取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。
1、原理
荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记 物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定 条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态 而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐 射形式释放出所有的光能，发射出波长较照 射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免 疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体 技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化 学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合 物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此 借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又 可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和 补体荧光抗体法。
直接法检测抗原
NCM病毒---金标单抗显色
DIGFA步骤简化、时间缩短。
❖ DIGFA检测操作程序
荧光色素
异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)
1、荧光抗体染色方法
直接法
间接法
2、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用
间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：
（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。 室温晾干。 （2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体 ，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育45min。 （3）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （4）加第二抗体IgG-FITC ，37℃湿盒中孵育45min。 （5）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （6）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。
间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病
间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒
直接ELISA
间接ELISA
间接酶联免疫吸附试验
操作步骤如下： （1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育60min
。 （2）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （3）加AP-IgG 为第二抗体，37℃湿盒中孵育45min。 （4）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （5）加NBT/BCIP底物缓冲液发色10min， （6）出现颜色加终止液终止反应。 （7）用酶标分析仪在405nm,处测定各孔的吸光度，计算P／N（样品光吸收值
斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用 与研究进展
是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和 HIV等。
沉淀凝集反应
双向免疫扩散沉淀线示意图
琼扩反应
中和实验
荧光免疫技术
荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫 化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术 的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学 及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的 、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛 应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相 应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原 、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的 研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等 方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏 感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解 决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复 杂。
与阴性对照的值），判定ELISA反应结果。大于2.1时可判断为阳性。 以最大显色至阳性的显色孔50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。
图 DOT BLOT方法筛选结果图。
免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布
细胞免疫化学法检测病毒感染
四、Western blot
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 。 原理及步骤 样品
关于免疫学检测方法
检测技术种类
一、免疫学检测
免疫凝集试验 免疫沉淀试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 免疫印迹试验
细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应 中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价
1.稀释抗体
管号 磷酸盐缓冲液
斑点免疫金渗滤法原理：
NCM为固相载体-----通过渗滤----抗原与抗 体在膜上快速反应-----标记的胶体金堆积显 色。
胶体金
吸水垫
抗原
抗体
NCM
临床应用： ❖ 间接法测抗体：
NCM 抗原----样品抗体----金标抗抗体显
色
❖ 夹心法测抗原：ຫໍສະໝຸດ NCM多抗----样品抗原----金标单抗显色。
聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （SDS-PAGE )
转移（印迹）于硝酸纤维素膜
加抗体检测某种特异性蛋白质
West Blot
图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果
免疫电镜技术
免疫电镜技术（immune electron microscopic technique） 是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方 法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞 水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一 技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子 水平。主要有以下几种技术。
➢ 铁蛋白抗体法 ➢ 酶标记抗体法 ➢ 重金属标记抗体法
图 胶体金标记免疫电镜结果[(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm]
胶体金免疫技术
胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能 与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所 有的大分子物质都可被金标记，而且标记后 大分子物质活性不发生改变。
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兔抗X菌血清
0.1 0.1(1 0.1(
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0.1( 3)
0.1( 4)
0.1(5 0.0 )
2.玻片凝集法
A.用1ml移液枪取6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴 磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的X菌液。
B.牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。 C.后取5、4……1号管的溶液逐个重复1、2步骤。 D.取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。
1、原理
荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记 物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定 条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态 而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐 射形式释放出所有的光能，发射出波长较照 射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免 疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体 技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化 学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合 物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此 借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又 可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和 补体荧光抗体法。
直接法检测抗原
NCM病毒---金标单抗显色
DIGFA步骤简化、时间缩短。
❖ DIGFA检测操作程序
荧光色素
异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)
1、荧光抗体染色方法
直接法
间接法
2、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用
间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：
（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。 室温晾干。 （2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体 ，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育45min。 （3）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （4）加第二抗体IgG-FITC ，37℃湿盒中孵育45min。 （5）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （6）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。
间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病
间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒
直接ELISA
间接ELISA
间接酶联免疫吸附试验
操作步骤如下： （1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育60min
。 （2）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （3）加AP-IgG 为第二抗体，37℃湿盒中孵育45min。 （4）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （5）加NBT/BCIP底物缓冲液发色10min， （6）出现颜色加终止液终止反应。 （7）用酶标分析仪在405nm,处测定各孔的吸光度，计算P／N（样品光吸收值