硫酸铵纯化抗体
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1.兔抗人IgG抗体的初步纯化
( 硫酸铵沉淀法)
一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯
化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二、试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫
酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器
三,操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
(一)配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液(SAS)(4.1 mol/L, 25 ° C ).
(二)沉淀 1.样品(如腹水)20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片; 2.保留上清液并测量体积; 3.边搅拌边慢慢加入等体积的
SAS 到上清液中,终浓度为 1 : 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜(4 ° C ),使蛋白质充分沉淀。
(三)透析 1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min (4 ° C )。弃上清保留沉淀; 2.将沉淀溶于少量( 10-20ml ) PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48
四,应用提示
(一)先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1.
边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中,使浓度为0.5:1
(v/v) ; 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或过夜
( 4 ° C );3.3000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C ),保
留上清液;上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到
沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 4.上清
液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀
溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 5.杂蛋白与欲纯化蛋
白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是
非常有效
(二)为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析;硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。
纯化产物的鉴定:
(1)效价测定 : 采用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1∶ 1
000 开始倍比稀释)检测抗体的效价。
(2)Ig亚类 ( 型 ) 的鉴定 : 用小鼠 Ig亚类检测试剂盒鉴定杂交瘤细胞培养上清中 mA b 的类和亚类。
(3)westernblot 鉴定抗体特异性 : 取 5 μ g 人 IgG 经SDS-PAGE后 , 转移至硝酸纤维素膜上 , 用 5 0 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h。依次滴加封闭液稀释的 5 mg/L纯化抗体 (室温孵育2 h 或 4℃过夜 ,洗膜3次)及1∶1 000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠 Ig G(室温孵育1 h, 洗膜 3次)。最后加 DAB显色 ,观察结果。
(4)相对亲和力测定 : 以 IgG与抗体结合曲线上部趋于平坦的一段(平台期)的吸光度值(A)为100%, 查出 A值为 50%点的抗体的浓度,以此来表示各株的相对亲和力。
1.为什么需要用透析袋透析?用透析袋透析以彻底除去硫酸氨;
2.纯度如何简单鉴定?用BSA试剂盒测定抗体浓度,也可以用考马斯法、紫外法、双缩脲法等测定。
3.为什么要进行活性鉴定?进行活性测定可以判定抗体效价,初步确定抗体的稀释倍数,能便于找到最好的稀释倍数,避免背景深等不良影响。
5.纯化产物如何保存?注意事项?
纯化产物可以冻干保存、过滤除菌后加叠氮化钠4℃保存、或加50%甘油-20℃保存,也可直接置于液氮中保存。