微生物群落基因指纹分析

Bb-PEG 电泳
双苯酰亚胺--聚乙烯二醇电泳是一种简单和
快速的电泳方法，用以检测不同的细胞培养和 不同环境中样品基因的PCR产物的序列变化。 电泳在含有双苯酰亚胺配基的琼脂糖凝胶中进 行，长链和PEG交联。双苯酰亚胺约束AT富集 的序列。高A+T含量的DNA分子比低A+T含量 的DNA分子在胶中所受阻力更大，因此能够分 离各种片段。
T-RFLP
这种技术跟RFLP很相似，利用荧光标记PCR 产物。这种产物在进行PCR扩增的时候用一种 带荧光的引物使尾端带有标记。在接下来的测 定中，扩增的基因将被限制性酶消化，让后在 DNA自动测序仪中进行检测。只有带有荧光 标记的限制性片段即末端限制性片段才能被检 测出来。Avaniss-Aghajani 和 co-workers最先 运用这种方法来鉴定复杂混合物中的不用细菌。
RAPD和DAF
随机扩增多态性DNA（RAPD）被用于跟踪不同土壤 微生物群落对2，4—D的反应。Breen et等用一个相似 的方法，名字叫做DNA扩增指纹法（DAF） ，来比 较不同生物反应器中的微生物群落，以及一个生物反 应器中的群落变化。这两种方法都用来5-10碱基的随 机引物，这些随机引物在基因组DNA的不同部位复性， 使PCR产物分生出不同的长度。产物在琼脂糖胶或聚 丙烯酰胺凝胶中进行分离，然后用EB染色或银染显示 出条带。
基因指纹分析技术的意义
微生物通常很小，外部特征也不显著，无法通过形态学去 分类。
自然界中99%的微生物是无法被分离 。 为了对微生物多样性执行生态系统机能所发挥的作用更好
地理解 ，一种能弥补传统微生物测定法的不足的技术是很 必须的。 基因指纹分析技术基于各种独特的核苷酸物理分离片段， 能描绘出微生物群落的结构轮廓。 最重要的是，这种方法能够同时分析多个样品，因此能够 比较不同环境中微生物群落的遗传多态性，还能随时间变 化研究单个群落的习性。
1、你还能说出DNA指纹鉴定技术在其他方面的应
用吗？
答案
The end
2、DNA指纹鉴定技术的应用：
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RFLP 和 ARDRA
限制性片段长度多态性和扩增rRNA片段限制 性分析都能用于微生物群落的特征分析。将 16S rDNA 片短用通用引物进行PCR扩增，再 用限制性酶消化，然后通过琼脂糖或聚丙烯酰 胺胶电泳，最后进行显色，即可进行分析。
Martinez-Murcia 等用RFLP分析16S rDNA 片 段的PCR扩增产物来评估多盐池塘的原核生物 的多态性。
DGGE 和 TGGE
变性（温度）梯度凝胶电泳法，将收集 到的混合微生物基因组DNA和通过特异 引物获得PCR产物的混合物，在含有线 性梯度的DNA变性剂（或梯度温度条件 下）的聚丙烯酰胺凝胶中电泳.不同DNA 分子中不同的序列排列影响双链的熔解， 因此不同序列的分子分离。
该技术常被用于构建混合群落的基因图谱，研 究细胞群落的群体动态和不同基因在混合群落 的表达，所以可以以此来监视增殖培养，比较 DNA分离方法，屏蔽克隆库的重复，测定 rRNA 操纵子的微观不均一性。该技术最重要 的一点是条带可以保存在胶中，随后的排序可 以显示群落成员种系发生的信息.
无法获得种系发生信息; 重复性差
Bb-PEG 简单；不需要昂的设 备
RFLP/ARD 直接；不需要昂的设
RA
备
低分辨率；Bb-PEG 染料比较难获 得
很多条带与群落成员无关
TRFLP
高分辨率;泳道内标 记;直接定量分析片 段
无法获得种系发生信息，设备昂贵
讨论
基因指纹技术用于研究不同微生物群体的遗传 差异、环境变化之后对细菌群落的变化的监视 既简便又快速。这些技术都能用于描述性技术 分析，而且只有几种方法，如LMW RNA指纹、 DGGE、SSCP，能通过杂交分析或分离条带的 序列分析对群落成员进行进一步的鉴定。基因 指纹技术的发展将使的越来越多多工作在微生 物生态方面的科学家产生浓厚的兴趣。
低分子量RNA指纹技术
该基因指纹技术的用于描绘低分子量RNA(5S 核糖体RNA；转运RNA)已有10年多了，这项 技术通过直接从环境样品中提取总RNA，通 过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。显影后可将 图谱扫描然后储存在数据库中方便比对。
到目前为止，克隆16S rDNA的PCR扩增产物 是检测微生物多样性和鉴定混合的微生物群落 种类构成最成功的方法。
技术
优点
பைடு நூலகம்
缺点
LMW RNA 直接，不需要体外扩 增
DGGE/TGG 能够鉴定群落成员 E
SSCP
能够鉴定群落成员
RAPD/DAF 不需设计特殊引物
RNA降解迅速;LMW RNA 长度变化大， 种系发生信息有限
只能分析短片段（550 bp) ;有时 会形成双链或异源分子，影响结果
只能分析短片段(150-400 nt);重 复性差
SSCP
单链构象多态性技术通过特异引物扩增DNA 片段，将PCR产物变性后直接在非变性胶中电 泳。
分离基于单链DNA的不同的折叠构象，因此 影响电泳迁移率。
Lee 和 coworkers用此技术来研究天然细菌群 落的结构和多样性。 Schwieger 和 Tebbe 用 PCR-SSCP来分析不同植物根际的微生物群落。