植物基因工程载体及其构建
植物表达载体构建
植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合 PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年 Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用
用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【摘要】为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒栽体pNULPGE200.该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflowermosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site).利用pNULPGE200构建植物基因表达栽体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ (neomycinphosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP (synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选.本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒栽体pBI121构建了植物表达栽体,验证了文中质粒栽体的实用性.%In order to overcome the defects that the commonly used plasmids have a limited number of restriction sites for target gene cloning, and lack expressing elements such as promoter, terminator and selection marker genes, a plasmid named pNULPGE200 for construction of plant gene expression vector was modified. The plasmid contains cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (NOS) ter-minator, and a multiple cloning site between them. The target gene amplified by PCR can beinserted directly between the 35S promoter and the NOS terminator, and can be expressed in plants stably. pNULPGE200 also contains two independent expression marker genes, encoding neomycin phosphotransferase Ⅱ(NPT Ⅱ) and synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation (sGFP), which can be used for mutual selection in plant transformation. The practicability of the plasmid was confirmed by comparing with a conventional plas-mid pBI121 in the construction of the gene encoding xylene monooxygenase from Pseudomonas putida to create a plant gene expression vector.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2018(022)002【总页数】8页(P114-121)【关键词】质粒改造;植物基因表达载体;载体构建;二甲苯单加氧酶基因【作者】安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【作者单位】宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】Q782自1984年首次获得转基因烟草[1]以来,以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。
基因工程 载体构建
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Oligo DNA的Tm值 引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度，碱基组成， 引物使用缓冲的离子强度也有关。长度为25mer以下的引物， Tm计算公式为： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃，一般采 用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。兼并碱基Tm值可 以折算。 酶切位点和保护碱基不计算在内，而只计算与模板互补的 碱基序列的Tm。
Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白 表达系统。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚 克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。当基 因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确 的方向和阅读框。Gateway™也有助于进行带不同数目纯化 和检测标签的表达 。 Gateway™利用了位点特异重组， 所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接 酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移 您感兴趣的基因到Gateway™改造过的 的各种表达载体（目 的载体）。
根癌农杆菌（Ti质粒）
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子， Ti质粒具有五个主要功能区域，它们分别是 T-DNA、质粒转移(plasmid transfer)、冠瘿 碱代谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和 毒性区域(vir)。 T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色 体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交 界处的25bp不完全直接重复(imperfect direct repeats)，右端的序列称为右界(right border, RB), 左端的为左界(left border,LB)。 T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以 将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后， 将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA 仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物 基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。
生物技术 园艺植物基因工程步骤
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
植物基因工程
转化体的鉴定
转基因植物的鉴定主要集中在DNA、RNA和目的蛋白三个层面上。 1.DNA水平
southern 杂交；斑点杂交（dot blotting）:是在southern 杂交基础上发展而来的
快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器 上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再按southern 杂交法进行杂交；PCR。 2. RNA水平 Northern 杂交；RT-PCR（逆转录PCR）：先将mRNA转录成cDNA，再设计一对 引物扩增杂交分子。 3.蛋白质水平 western 杂交,elisa等。
• 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小
Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、 Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基
•构建植物基因Biblioteka 程载体 •将外源基因导入植物受体 •转基因植物的鉴定
1.目的基因的分离和克隆
已知基因的获得： • 化学合成法 • PCA显示差异技术筛选差异表达基因， • 差异蛋白谱表达技术筛选功能基因
2.构建植物基因工程的载体
导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选 择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。 理想报告基因的基本要求： 受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。 它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。
最常用的报告基因
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）; 氯霉素乙酰转移酶基因； 荧光素酶基因; 分泌型碱性磷酸酶 ; 荧光蛋白家族
植物基因工程的一般步骤
植物基因工程的一般步骤一、目的基因的获取在植物基因工程中，首先需要获取目的基因。
目的基因是指那些对植物性状具有重要影响的基因，通过改变这些基因的表达或功能，可以实现植物的遗传改良。
目的基因的获取通常采用分子克隆技术，从植物基因文库或通过PCR等技术直接从植物组织中克隆目的基因。
二、植物表达载体的构建获取目的基因后，需要构建一个植物表达载体。
植物表达载体是一种将目的基因转移到植物细胞内的质粒或病毒载体，通常包括启动子、终止子等调控元件，以及选择标记基因等。
构建植物表达载体的目的是为了确保目的基因在植物细胞内的正确表达。
三、将目的基因导入植物细胞构建好植物表达载体后，需要将其导入到植物细胞中。
导入方法通常采用基因枪法、农杆菌转化法、花粉管通道法等。
这些方法各有优缺点，应根据目的基因和植物种类选择合适的方法。
四、目的基因整合到植物基因组中导入植物细胞后，目的基因需要整合到植物基因组中才能实现其功能。
这一过程通常需要采用分子生物学技术进行检测和鉴定，以确保目的基因已经正确地整合到植物基因组中。
五、目的基因的检测与鉴定为了确认目的基因是否已经表达以及表达水平如何，需要进行目的基因的检测与鉴定。
这一过程通常采用分子生物学技术，如PCR扩增、DNA测序、Northern blot、Western blot 等，对目的基因的表达进行检测和鉴定。
六、转基因植物的筛选与培育在目的基因成功整合到植物基因组中并表达后，需要筛选和培育转基因植物。
这一过程通常采用抗性筛选、分子检测等技术，对转基因植株进行多代选育，培育出遗传稳定性好、农艺性状优良的转基因植株。
七、转基因植物的遗传稳定性检测为了确保转基因植株的遗传稳定性，需要进行遗传稳定性检测。
这一过程包括对转基因植株的DNA进行多代跟踪分析，以评估目的基因的遗传稳定性及其对后代的影响。
八、转基因植物的安全性评估与环境释放在转基因植物培育成功后，需要进行安全性评估与环境释放。
植物表达载体构建
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
第六章_植物转化载体的构建
• 卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体 • 例：pGV3850是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来
植物基因转化载体系统
Ti质粒
天然Ti质粒存在的缺陷
目的基因
中间表达载体的特性
中间表达载体
改良的Ti质粒
转化载体系统
卸甲载体
一元载体系统
构建
双元载体系统
存在缺陷
• Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因 工程中难以操作；
• 很难找到单一的酶切位点； • 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长
T-DNA区（transferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌侵 染植物细胞时，从Ti质粒上切 割下来转移到植物细胞的一段 DNA，称为转移DNA。该片断上 的基因与肿瘤形成有关（致瘤
基因）。
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，该区段 上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传 过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性
Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成
毒性区中各位点的表达情况分为两种：
组成性表达
植物诱导性表达
Vir区(virulence region)：该区段激活T-DNA的转移， 使农杆菌表现出毒性，故称为毒性区。它与T-DNA区
相邻，合起来占质粒的1/3。
Vir基因的功能：
诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上-VirA蛋白
Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段-VirD蛋白
T-DNA被转入植物细胞，整合到寄主基因组中 --VirD、E蛋白
植物基因工程载体
植物基因工程载体转查尔酮合酶矮牵牛花抗CMV病毒转基因番茄抗CMV病毒转基因甜椒植物基因工程载体分类l质粒转化载体l病毒转化载体Ti质粒转化载体是目前最主要的、最常用的植物基因工程载体。
根瘤农杆菌及Ti质粒的发现Ti质粒是在根瘤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。
根瘤农杆菌及Ti质粒的发现根瘤农杆菌感染植物细胞后，根瘤农杆菌的Ti质粒上的T-DNA被转移并整合到植物细胞染色体上，并引起植物形成冠瘿瘤。
冠瘿瘤根瘤农杆菌Ti质粒在结构上可分为四部分：l T-DNA又称转移DNA区：在农杆菌侵染植物体时，其从Ti质粒上被切割并转移到植物细胞中去，该序列与肿瘤形成有关l毒性区域即vir(virulence)区域：该区段的基因表达激活T-DNA的转移，使植物致瘤。
l接合转移区：存在与细菌接合转移有关的基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移l复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制。
只有Vir区和T-DNA区与冠瘿瘤生成相关。
T-DNA的结构和功能结构特点：左右两端（TL、TR）具有25个碱基对的顺向重复序列；去除TR，失去T-DNA转移和整合功能，不能致瘤；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。
T-DNA上编码的基因有两类：一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢的基因；另一类是诱发肿瘤的基因转移过程：农杆菌感染后，植物细胞接受刺激，释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；农杆菌粘附到植物细胞壁。
植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒，并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。
受伤的植物细胞产生乙酰丁香酮乙酰丁香酮激活vir基因农杆菌T-DNA整合到植物基因组中合成植物生长素、细胞分裂素、冠瘿碱，冠瘿瘤形成野生型的Ti质粒作为载体的缺陷l Ti质粒分子质量过大，一般在160-240kb，操作麻烦。
l缺乏合适的克隆位点l T-DNA区导致植株产生冠瘿瘤，阻碍细胞的分化和植株的产生；l缺乏大肠杆菌的复制起始位点和筛选标记。
基因工程-基因表达载体构建(2)
（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交 方法，用 DNA与RNA杂交 方法检测目的基因是否转录，用 免疫（ 抗原抗体反应 ）法检测目的基因是否表达。另外也 让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。 可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱 ；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞 受精卵 等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的 方法有 等；农杆菌转化 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 显微注射法 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌 细胞壁 粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的 基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制， 由于 细菌繁殖的速度非常 ，在很短的时间内就能够获 快 得大量的目的基因。
途径 方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因 鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓载入 运载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离 目的基因
人工合成基因（真核细胞） 反转录法
目的基因mRNA ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸 序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物 共用一套遗传密码 。 基因工程的意义： 。 目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺 中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？
植物表达载体构建
卸甲载体（disarmed vector） 1．Onc-卸甲载体： 所谓的卸甲载体就是无毒的（ non-oncogenic）、即切 除了 Onc 致瘤基因的 Ti 质粒载体。在这种 Onc- 载体中，已 经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取 代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源DNA片段，都 可以通过与 pBR322 质粒 DNA 的同源重组，而被共整合到 Onc-Ti质粒载体上。最常用的 Onc-卸甲载体为pGV3850， 它保留了两个边界和右边界附近的 nos基因（胭脂碱合成酶 基因），可作为鉴别转化细胞的一个标记； T-DNA内部的 Onc 缺失 区被 pBR322 序 列（ 含 Apr 基 因 ）所取 代 。插入 pBR序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成 共和体，即重组体。 2. Onc+卸甲载体： 不去除Onc基因的卸甲载体，用于特殊用途。
第多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因 枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介 导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
植物表达载体构建
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
（ 1 ）共整合系统中间载体：含有与 Ti 质粒 T-DNA 区同源的 序列，此外含有pBR的序列，在其被引入农杆菌后即可高频 地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；具有一个或多个 细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有 bom位点 （接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，bom位点 的存在可使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；含有植物 阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新 霉素磷酸转移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基 因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶 切点，以利于外源基因的插入；无 Ti 质粒的边界序列 ( 见下 图 )。 （ 2 ）双元载体系统中间载体：其与共整合载体的不同之处 是：无同源序列；具有LB和RB；无ColE复制点。
（四）植物基因转化载体系统的构建：
上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外 源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌 的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必 须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体 Ti 质粒 中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能 应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的 复合型载体，故称之为载体系统。
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究：植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究是现代生物技术领域的一个重要分支，它通过操纵植物的基因来改变其性状和功能，为农业、生物医学和环境保护等方面提供了广阔的应用前景。
本文将介绍植物基因工程的原理和遗传转化技术的发展现状，以及其在农业和医学领域的应用。
一、植物基因工程原理植物基因工程是指通过人为干预植物基因组，将外源基因导入植物细胞，并使其在植物中表达。
其核心技术是DNA重组技术，具体包括以下几个步骤：1. 外源基因的克隆：将具有特定功能的基因从其他生物体中分离出来，并经过体外扩增，得到足够的DNA片段。
2. 载体构建：将目标基因与适当的表达载体连接，构建成重组DNA。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化方法：将重组DNA导入植物细胞。
常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化等。
4. 选择与筛选：利用选择标记基因或者报告基因等，对经转化的植株进行筛选和鉴定，确保目标基因已经成功导入植物细胞。
5. 后续培养：将转基因植株培养至成熟植株，并进行繁殖和观察，验证目标基因的功能和表达。
二、遗传转化技术的发展现状随着生物技术的不断进步，植物遗传转化技术也得到了广泛应用，取得了许多重要成果。
目前常用的植物遗传转化技术包括农杆菌介导的转化、基因枪介导的转化、电击法等。
农杆菌介导的转化是最常用的植物遗传转化技术之一，利用农杆菌通过水分或创伤进入植物细胞，将外源基因导入植物基因组。
该技术具有高效性和选择性，并且适用范围广泛，在获得转基因植株方面具有重要作用。
基因枪介导的转化是一种直接将外源DNA通过高速银粒枪或金粒枪射入植物组织的方法。
该技术能够克服农杆菌介导的转化对组织的要求较高的限制，使得更多的植物种类能够进行遗传转化。
电击法是一种利用暴露在电场中的植物细胞的特定瞬间可逆孔效应，使得外源DNA通过电穿孔方式导入细胞的方法。
该技术常用于难以转化的植物种类，如谷物、树木等。
植物基因工程在植物育种上的应用PPT课件
磷酸二酯法的合成原理
① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH，以 保证合成反应的定向进行。
② 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另 一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
③ 用酸或碱的脱保护
磷酸二酯法合成过程
磷酸三酯法的合成
单链DNA噬菌体的特点： （1）ssDNA （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌， 并产生噬菌斑。 （4）不存在包装限制。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链 分子，便于作探针或测序。
M13噬菌体在感染细胞中的复制
M13噬菌体的包装
（1）高拷贝数的质粒载体 （2）低拷贝数的质粒载体 （3）失控的质粒载体 （4）插入失活型质粒载体 （5）正选择的质粒载体 （6）表达型质粒载体
质粒载体模式图
噬菌体载体
噬菌体是一类细菌病毒，由蛋白质外壳和内包裹 着的DNA（双链、单链、线性、环状等）构成。
单链噬菌体载体
来自单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体，如 M13。
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列 体外引物定向酶促扩增技术。
PCR技术的五要素和步骤
参加PCR反应的物质 主要有五种
植物基因工程中的λ噬菌体载体
•右臂：长约10kb，控 制溶菌和溶原生长最重 要的调控基因和序列、 以及λDNA复制起始均 在这区域内。
➢ 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似 性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生 长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌体载体
λ早使用的载体 系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于 全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组 噬菌体颗粒的感染活性在替换或插入某些标志基因，如上述的可 供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。
• 建立重组λDNA分子的体外包装系统。
• 与一般的质粒载体不同, 噬菌体转染前需要利用噬菌体外 壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物
• )在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌 体载体
2020/11/20
植物基因工程中的λ噬菌体载体
载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重 组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工 具。 植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的 基因需要采用不同的载体。 组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：
右臂，填充片断的存在会影响连接效率， 必须纯化左臂和右臂。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（3）外源片断与载体的连接 • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联
体，以利于将两个cos位点之间的片断装入 噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力 的噬菌体颗粒
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得实习生：李宇皓，实习时间为2017年11月27日-12月25日。
这次实习是去农学院，具体是一个专业—园艺科学。
这是我第三次参加此类型的实习了。
前两次都是上课的形式，今天终于亲自动手操作了！还不错吧!这也算是我实践性比较强的一门课了。
实习内容包括有：《植物基因组文库构建》、《植物多样性》、《植物基因组工程与应用》、《植物抗病虫害》。
最后进行分组讨论会，向指导老师汇报成果，感觉很棒啊！从10月30号到12月13号，五天时间里，我们几个同学根据实际情况，做好各项准备，完成了毕业设计的前期任务，并在第六周开始正式着手整个课题的研究工作，可谓万事俱备只欠东风了！
实验目的和要求：1.掌握植物基因组文库构建方法2.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的方法3.掌握基因组文库构建与高密度筛选4.熟悉多克隆抗体技术5.理解基因工程原理6.通过外源基因表达产物对花卉新品种的选育作用以及利用反义技术实现基因定位和标记
等相关问题。
实习步骤（含内容）：实习一：了解植物基因组文库构建概念及意义；制定实验方案；进行文库构建；并利用文库分析植物进化史。
实习二：分离转录间隔区序列；目的基因与其他基因的分离纯化；目的基因的克隆及转化载体构建；目的基因的 PCR 扩增、测序与分析；目的基因片段的克隆；基因片段的连接；基因文库构建及质量检查。
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第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
二、T-DNA的基因结构与功能
三、Vir区操纵子的基因结构与功能
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
1. Ti质粒的遗传特性及类型 l Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗 传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子， 其分子量为95～156×106D, 约有200kb 组成。 l 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成 的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四 种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型 (nopaline)、农杆碱型（agropine）和农 杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱 型(succinamopine)
2. Ti质粒的功能区域
Ti质粒可分为四个区。
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移 到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因 与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占 Ti质粒DNA的三分之一。 （3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控 Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质 粒转移，因此称之为接合转移编码区。
二、T-DNA的基因结构与功能
1.T-DNA的发现 Chilton等人（1982）利用同位素标记的Ti质粒做 探针发现，加入高浓度烟草肿瘤细胞的DNA后，Ti质粒 DNA的复性速度有加快的趋势。这表明肿瘤DNA中有Ti 质粒的顺序，但该顺序不多，而且没有检测到完整的Ti 质粒。以后这些作者将章鱼碱型的Ti质粒B6-806用内切 酶Sma I分解成19个片段，分别用同位素标记做成探针， 然后与肿瘤DNA进行分子杂交，结果有二段Ti质粒的 DNA（3b和10c。）能和肿瘤DNA杂交，也就是Ti质粒 中这两段DNA是与肿瘤DNA同源的部分。进一步研究证 明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细 胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。这是首次 证明在高等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序。
2.T-DNA的结构特点
l Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb l T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；T-DNA含有激发和 保持肿瘤状态所必需的基因；T-DNA和植物DNA之间没有同源 l 在 T-DNA 的 5´ 端 和 3´ 端 都 有 真 核 表 达 信 号 。 如 TATAbox 、 AATAAbox及polyA等。 l T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列 （border sequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界 （BR或TR）。(图8-4)。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边 界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。 其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两 部分,是完全保守的。 左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能 致瘤,这里几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA 转移中的重要性。
第三节 农杆菌Ti质粒基因转化机理
第一节 植物基因工程载体种类
根据其功能和构建过程，可分为以下种类。 （1）目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因。与 微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的E. Coli小质粒为载 体。 （2）中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒。是由 大肠杆菌质粒插入T-DNA片段、目的基因和标记基因等构建 而成。 （3）中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体。是 构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，是构建转化 载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：是最后用于目的基因导人植物细胞 的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构 建而成。
三、Vir区操纵子的基因结构与功能
1. Vir区操纵子的基因结构
除T-DNA外，Ti质粒的vir区也是农杆菌致 瘤所必须的。Vir区仅位于T区DNA左侧。两者 之 间 的 距 离 常 随 Ti 质 粒 类 型 不 同 而 有 差 异:Octopine的间隔距离较大,而Nopaline间隔 距离很小。Octopine Ti质粒的Vir区大小为 40bp,含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(旧称 PinF)等8个操纵子(operon),共24个基因。它们 协同调节，形成一个调控子(regulon),起共调 控作用(co-regulation)。而Nopaline有7个操纵 子,比Octoppine少一个VirF操纵子。
2. VirA操纵子的诱导表达及功能
对VirA基因进行顺序分析发现, VirA是单个基因组 成,分子大小为2.8kb，仅编码一条多肽。Vir基因在接 受植物细胞产生的创伤信号分子后才能转录活化，其 中 首 先 是 VirA 编 码 一 种 结 合 在 膜 上 的 化 学 受 体 蛋 白 （ membrane bound chemoreceptor protein ， 92kD），可直接对植物产生的酚类化合物感应，称为 感应蛋白（sensor）。当AS与TM-2受体部位结合后， 会使整个VirA蛋白构象发生变化，其C端活化。VirA蛋 白的胞质区有自激酶（autokinase）的功能，可在保守 的组氨酸残基上磷酸化，从而VirA蛋白被激活。磷酸化 的VirA蛋白具有转移其磷酸盐至VirG蛋白的能力，使 VirG蛋白激活。
3. VirG操纵子的诱导表达及功能
VirG操纵子小于VirA，只有1.0kb，同样是单基因结 构，只能编码一条多肽，被称为VirG蛋白，即DNA结合活 化蛋白（DNA-binding activator protein）。它的C端已 知有DNA结合活性。它的N未端部分具有磷酸化的酸性结 构。当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到VirG蛋白（30kD） 保守的天冬氨酸盐残基上时，使VirG蛋白活化。活化的 VirG蛋白可能以二体或多体形式结合到Vir区启动子的特定 区域，从而成为其它Vir基因转录的激活因子，打开VirB、 C、D、E、H等几个基因。并己证明，VirA或VirG突变后会 减弱或完全失去对其它Vir位点活化的诱导。VirA及VirG的 这种调控作用被称为双因子调控体系（two一component regu1atory system）。
4. VirH、F及Tzs操纵子的诱导表达及其功能
这些基因对质粒是特异性的 ，在Octopine中有VirF、 VirH，在Nopaline中有Tzs。 VirH：可能对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒 作用，从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制，可增 强致瘤能力。 Tzs：大部分Nopaline菌株的Ti质粒上均有Tzs基因,即转 运玉米素合成酶基因（trans-zeatin synthease gene）， 在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素 被植物所吸收后，能促进农杆菌感染部位的植物组织脱 分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。 VirF操纵子编码一个23kD蛋白，它与任何数据库中所有 蛋白质的序列无明显同源性。最近采用报告基因连接插 入法研究发现，VirF在T-DNA运输时发挥作用。
T-DNA区编码的基因
第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因。 第二类是致瘤基因，前两个基因被称作为生长素基因（Aux）。 Aux基因突变将诱导肿瘤细胞茎芽产生,因此Aux基因后来被称作 Tms （tumour morphology shoot）基因，即肿瘤形态茎芽基因 或Shi（shoot induction）基因，即茎芽抑制基因。目前已查明， 实际上Aux基因包括两个基因，一个是Aux-l（Tms-1），编码色氨 酸单加氧酶（typtophan mono-oxygenase），将色氨酸转变成吲 哚乙酰胺（indol acetamid，，IAM），故现在也称为Iam基因；另 一个是Aux-2,编码吲哚乙酰胺水解酶，将IAM转变成乙酸吲哚IAA， 现称为iaaH基因。第三个基因是细胞分裂素基因（cyt），其突变将 引起易生根特性。故称为Tmr（tumour morphology root）基因， 即肿瘤形态根基因或Roi（root induction）基因，即根抑制基因。 Cyt基因编码异戊烯基转移酶（isopentenyltransferase），催化异戊 烯基焦磷酸盐（isopentenylpyrophosphate）和AMP形成细胞分裂 素即异戊烯基-AMP（isopentenyl-AMP），故现称为Ipt基因。
（4）Ori区（origin of replication）
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
3. Ti质粒的生物学功能
Ti质粒的功能可归为以下7个方面: ① 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一 些细胞分裂素的活动。 ② 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态 学特征和冠瘿碱成分。 ③ 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的 能力。 ④ 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应 性。 ⑤ 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。 ⑥ 决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦ 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生 长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”。
T-DNA区编码基因的功能
Aux基因突变将阻断肿瘤细胞生长素的大量合成，使细 胞内的细胞分裂素与生长激素的比值升高。野生型肿瘤 细胞中细胞分裂素与生长素的比值为0．22，而突变型 该值上升到14.4，因此有利于芽的形态发生。同时Cyt 基因突变将会阻断细胞分裂素的大量合成，两者之间的 比值下降到0.02，因此有利于根的形态发生。 正是由于Tms和Tmr基因的表达，使转化植物细胞内激 素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主性特 性，引起癌变。Tms和Tmr基因是致瘤所必须的基因， 因此又称它们为致瘤基因（onc gene）。