植物基因工程载体及其构建

第一节 植物基因工程载体种类
根据其功能和构建过程，可分为以下种类。 （1）目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因。与 微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的E. Coli小质粒为载 体。 （2）中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒。是由 大肠杆菌质粒插入T-DNA片段、目的基因和标记基因等构建 而成。 （3）中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体。是 构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，是构建转化 载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：是最后用于目的基因导人植物细胞 的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构 建而成。
第八章
植物基因工程载体及其构建
植物基因工程载体种类 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 Ti质粒基因转化机理 Ti质粒的改造及载体构建 常用选择标记和报告基因
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
植物基因转化系统
l 1.载体转化系统（Ti质粒转化载体、Ri质粒转化载
体、病毒转化载体） l 2. DNA直接导入转化系统（原生质体、基因枪） l 3.种质转化系统（花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、 胚囊子房注射法）。 载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多、 机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统, 其中又以Ti质粒转化载体最为重要。
T-DNA区编码基因的功能
Aux基因突变将阻断肿瘤细胞生长素的大量合成，使细 胞内的细胞分裂素与生长激素的比值升高。野生型肿瘤 细胞中细胞分裂素与生长素的比值为0．22，而突变型 该值上升到14.4，因此有利于芽的形态发生。同时Cyt 基因突变将会阻断细胞分裂素的大量合成，两者之间的 比值下降到0.02，因此有利于根的形态发生。 正是由于Tms和Tmr基因的表达，使转化植物细胞内激 素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主性特 性，引起癌变。Tms和Tmr基因是致瘤所必须的基因， 因此又称它们为致瘤基因（onc gene）。
3. T-DNA上的编码基因及功能
T-DNA的转录有下述共同点： ①T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录。 ②T-DNA上每个基因都有各自的启动子。 ③基因的转录由植物细胞RNA聚合酶Ⅱ完成。 ④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信 号 ， 在 其 5’ 端 转 录 起 始 处 有 TATA 和 CAAT 盒 。 同 时 AATAAA加尾信号也在同一条链上发现，故T-DNA的转 录机理可能与真核生物相同。 ⑤植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活 性。
三、Vir区操纵子的基因结构与功能
1. Vir区操纵子的基因结构
除T-DNA外，Ti质粒的vir区也是农杆菌致 瘤所必须的。Vir区仅位于T区DNA左侧。两者 之 间 的 距 离 常 随 Ti 质 粒 类 型 不 同 而 有 差 异:Octopine的间隔距离较大,而Nopaline间隔 距离很小。Octopine Ti质粒的Vir区大小为 40bp,含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(旧称 PinF)等8个操纵子(operon),共24个基因。它们 协同调节，形成一个调控子(regulon),起共调 控作用(co-regulation)。而Nopaline有7个操纵 子,比Octoppine少一个VirF操纵子。
T-DNA区编码的基因
第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因。 第二类是致瘤基因，前两个基因被称作为生长素基因（Aux）。 Aux基因突变将诱导肿瘤细胞茎芽产生,因此Aux基因后来被称作 Tms （tumour morphology shoot）基因，即肿瘤形态茎芽基因 或Shi（shoot induction）基因，即茎芽抑制基因。目前已查明， 实际上Aux基因包括两个基因，一个是Aux-l（Tms-1），编码色氨 酸单加氧酶（typtophan mono-oxygenase），将色氨酸转变成吲 哚乙酰胺（indol acetamid，，IAM），故现在也称为Iam基因；另 一个是Aux-2,编码吲哚乙酰胺水解酶，将IAM转变成乙酸吲哚IAA， 现称为iaaH基因。第三个基因是细胞分裂素基因（cyt），其突变将 引起易生根特性。故称为Tmr（tumour morphology root）基因， 即肿瘤形态根基因或Roi（root induction）基因，即根抑制基因。 Cyt基因编码异戊烯基转移酶（isopentenyltransferase），催化异戊 烯基焦磷酸盐（isopentenylpyrophosphate）和AMP形成细胞分裂 素即异戊烯基-AMP（isopentenyl-AMP），故现称为Ipt基因。
3. VirG操纵子的诱导表达及功能
VirG操纵子小于VirA，只有1.0kb，同样是单基因结 构，只能编码一条多肽，被称为VirG蛋白，即DNA结合活 化蛋白（DNA-binding activator protein）。它的C端已 知有DNA结合活性。它的N未端部分具有磷酸化的酸性结 构。当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到VirG蛋白（30kD） 保守的天冬氨酸盐残基上时，使VirG蛋白活化。活化的 VirG蛋白可能以二体或多体形式结合到Vir区启动子的特定 区域，从而成为其它Vir基因转录的激活因子，打开VirB、 C、D、E、H等几个基因。并己证明，VirA或VirG突变后会 减弱或完全失去对其它Vir位点活化的诱导。VirA及VirG的 这种调控作用被称为双因子调控体系（two一component regu1atory system）。
（4）Ori区（origin of replication）
该区段基因调Βιβλιοθήκη BaiduTi质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
3. Ti质粒的生物学功能
Ti质粒的功能可归为以下7个方面: ① 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一 些细胞分裂素的活动。 ② 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态 学特征和冠瘿碱成分。 ③ 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的 能力。 ④ 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应 性。 ⑤ 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。 ⑥ 决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦ 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生 长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”。
第三节 农杆菌Ti质粒基因转化机理
T-DNA区基因的功能
研究方法： 用遗传学方法在T-DNA区中引 入转座子，使特定的基因发生突变，从而在肿 瘤细胞中T-DNA的一个或多个转录产物也随之 消朱。基因突变后不能转录出它所编码的 mRNA，这时可观察到带有突变基因的T-DNA 的植物细胞的表型，从而确定这些基因转录产 物的功能。用这种方法证明了编码两类转录产 物的基因序列：
2.T-DNA的结构特点
l Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb l T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；T-DNA含有激发和 保持肿瘤状态所必需的基因；T-DNA和植物DNA之间没有同源 l 在 T-DNA 的 5´ 端 和 3´ 端 都 有 真 核 表 达 信 号 。 如 TATAbox 、 AATAAbox及polyA等。 l T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列 （border sequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界 （BR或TR）。(图8-4)。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边 界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。 其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两 部分,是完全保守的。 左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能 致瘤,这里几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA 转移中的重要性。
二、T-DNA的基因结构与功能
1.T-DNA的发现 Chilton等人（1982）利用同位素标记的Ti质粒做 探针发现，加入高浓度烟草肿瘤细胞的DNA后，Ti质粒 DNA的复性速度有加快的趋势。这表明肿瘤DNA中有Ti 质粒的顺序，但该顺序不多，而且没有检测到完整的Ti 质粒。以后这些作者将章鱼碱型的Ti质粒B6-806用内切 酶Sma I分解成19个片段，分别用同位素标记做成探针， 然后与肿瘤DNA进行分子杂交，结果有二段Ti质粒的 DNA（3b和10c。）能和肿瘤DNA杂交，也就是Ti质粒 中这两段DNA是与肿瘤DNA同源的部分。进一步研究证 明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细 胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。这是首次 证明在高等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序。
2. VirA操纵子的诱导表达及功能
对VirA基因进行顺序分析发现, VirA是单个基因组 成,分子大小为2.8kb，仅编码一条多肽。Vir基因在接 受植物细胞产生的创伤信号分子后才能转录活化，其 中 首 先 是 VirA 编 码 一 种 结 合 在 膜 上 的 化 学 受 体 蛋 白 （ membrane bound chemoreceptor protein ， 92kD），可直接对植物产生的酚类化合物感应，称为 感应蛋白（sensor）。当AS与TM-2受体部位结合后， 会使整个VirA蛋白构象发生变化，其C端活化。VirA蛋 白的胞质区有自激酶（autokinase）的功能，可在保守 的组氨酸残基上磷酸化，从而VirA蛋白被激活。磷酸化 的VirA蛋白具有转移其磷酸盐至VirG蛋白的能力，使 VirG蛋白激活。
2. Ti质粒的功能区域
Ti质粒可分为四个区。
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移 到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因 与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占 Ti质粒DNA的三分之一。 （3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控 Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质 粒转移，因此称之为接合转移编码区。
第二节 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
二、T-DNA的基因结构与功能
三、Vir区操纵子的基因结构与功能
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
1. Ti质粒的遗传特性及类型 l Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗 传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子， 其分子量为95～156×106D, 约有200kb 组成。 l 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成 的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四 种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型 (nopaline)、农杆碱型（agropine）和农 杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱 型(succinamopine)
4. VirH、F及Tzs操纵子的诱导表达及其功能
这些基因对质粒是特异性的 ，在Octopine中有VirF、 VirH，在Nopaline中有Tzs。 VirH：可能对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒 作用，从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制，可增 强致瘤能力。 Tzs：大部分Nopaline菌株的Ti质粒上均有Tzs基因,即转 运玉米素合成酶基因（trans-zeatin synthease gene）， 在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素 被植物所吸收后，能促进农杆菌感染部位的植物组织脱 分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。 VirF操纵子编码一个23kD蛋白，它与任何数据库中所有 蛋白质的序列无明显同源性。最近采用报告基因连接插 入法研究发现，VirF在T-DNA运输时发挥作用。