第九章 微生物的突变和诱变育种
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固体培养基中渗入溶解性 差、可被特定菌利用的营 养成分,造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。
指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基,菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液
待筛选的菌株能 分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌, 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物 能力,工具菌就能围绕 该菌生长
括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。
6、产量突变型(metabolic quantitative mutant)
通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始 菌株的突变株,称产量突变型。有两种类型:正变株(plusmutant)、负变株(minus-mutant)
(二)突变率(mutation rate)
第四节 微生物诱变育种 1、诱变育种的基本环节
2、诱变育种中的几个原则
1)选择简便有效的诱变剂 2)挑选优良的出发菌株(original strain)
3)处理单细胞或单孢子悬液
4)选用最适的诱变剂量 5)充分利用复合处理的协同效应(synergism) 6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 7)设计高效筛选方案(筛选比诱变更重要)
抗阻遏和抗反馈突变型 抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的, 在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地 合成这一产物。
选育结构类似物抗性突变株
结构类似物是指一些和 细菌体内氨基酸、嘌呤、 维生素等代谢产物结构 相类似的物质
主要用于末端产物的积累
抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株 • 在抗生素产生菌选育中,通过筛选抗生素抗 性突变可提高抗生素产量。 • 抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外, 还能提高其它代谢产物的量。 条件抗性突变 • 因环境不同,能表现为"野生型"菌株的特性和突变型 菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。 •温度敏感突变常用于 提高代谢产物产量
某菌株或病毒经基因突变后,在某种条件下可正常地生长、 繁殖并呈现其固有的表型,而在另一种条件下却无法生长、繁 殖的突变类型。
4、形态突变型(morphological mutant)
指由突变引起的个体或菌落形态的变异,一般属非选择性
突变。
5、抗原突变型(antigenic mutant)
指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型,包
• 摇瓶培养法
摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角 瓶培养液中,振荡培养,然后,再对培养液进行分 析测定。 •特殊变异菌的筛选方法 营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 抗生素抗性突变株 条件抗性突变
营养缺陷型突变株 筛选步骤: 浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。
• 浓缩营养缺陷型菌株
某一细胞(或病毒粒)在每一世代中发生某一性
状突变的几率,称突变率。 (三)基因突变的特点
1.自 发 性:各种突变都可在无人为诱变因素处理下自发发生; 2.不对应性:突变的性状与引起的原因间无直接对应关系; 3.稀 有 性:自发突变的几率极低,一般10-6-10-9,但稳定;
4.独 立
性:某一突变既不提高也不降低其他任何基因的突变率;
5.可 诱变性:诱变剂可提高突变的几率,两种变异株无本质差别; 6.稳 定 性:是遗传物质结构上发生了稳定的变化,稳定,可遗传;
7.可 逆
性:任何性状都可发生正向突变,也都可发生回复突变。
(四)基因突变自发性和不对应性的实验证明
1、Luria 等的变量试验(fluctuation test)
2、Newcombe的涂布试验
生长谱法
组合补充培养基法
营养缺陷型的应用
利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子
天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制
通过诱变处理,获得高丝氨酸缺陷型突变菌株, 该突变型不能产生苏氨酸。
在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长, 并且因为消除了反馈抑制
突变型能过量生产L-赖氨酸
指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增 添(插入)或缺失,从而使该处后面的全部遗传密码的阅读 框架发生改变,并进一步引起转录和转译错误的一类突变。 诱变剂:ICR(美国一癌症研究所名称)类化合物: 原黄素,吖啶黄,吖啶橙等。 诱变机理:至今不清。 结果:加3、减3;加(减)1,短距离减(加)1;影响小。 增(减)1、2、4、5引起后面全变。
3、Lederberg等的影印平板培养法 (replica plating)
(五)基因突变及机制
1、诱发突变(induced mutation )
诱发突变简称诱变,是指通过人为的方法, 利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发
突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素,
都称诱变剂(mutagen)。
(inversion),也包括染色体数目的变化。
转座(因)子:在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段 DNA顺序。 其跳跃过程往往导致DNA链的断裂或重接,产生重组交换、基因 启动或关闭,使突变发生。 转座(因)子主要有三类:IS、Tn、Mu。
2、自发突变
自发突变(spontaneous mutation) 是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率 突变。 自发突变的原因:
生长谱法(auxanography)
3)抗药性突变株的筛选
梯度平板法:
如:选育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株
突变株:
①产生了可分解异烟肼的酶; ②能合成更高浓度的吡哆醇.(多) 获突变酵母的吡哆醇产量提高7倍.
方法:
10mL普通培养基→斜放→凝固→平放→ 10mL药物培养基 →凝固→涂诱变酵母→选厚药区菌落→检验
一、化学诱变剂
碱基类似物 二、物理诱变剂 非电离辐射类因子和电离辐射类因子两种 三、生物诱变剂
(一)转座诱发突变
(二)转化诱发突变 (三)转导诱发突变
(四)定点诱导
第三节 突变体的选择和检出
一、基因的突变延迟 原因:
突变前所产生的物质仍然在细胞中存在活性 诱变剂作用在DNA的一条链上 多核细胞,所有的核都变为变异的核时细胞才会表现
组成酶变异株的筛选
诱导酶的生产需要诱导物,而且受到 诱导物的种类、数量以及分解产物的 影响。能迅速利用的碳源(如葡萄糖) 会引来自百度文库酶合成的减少,诱导物有时又 比较昂贵。
生产成本提高
控制酶合成的调节基因发生了变异
诱导酶转变成组成型酶 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法 • 恒化器法:恒化器常被用于微生物的“驯化”,添加不 能起诱导作用的低浓度底物,缓慢生长 • 循环培养法:利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的 培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液,从而使组成酶 变异株得到富集。 •诱导抑制剂法:加入诱导抑制剂如α-硝基苯基-β-岩藻 糖苷阻止某些诱导酶的合成
致死 营养缺陷
抗性突变菌株的筛选方法 • 一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中, 一次性筛选出少量抗性变异株。
噬菌体抗性菌株
耐高温菌株
• 阶梯性筛选法
梯度平板法
纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸(如新华六号)打成小圆片,并使 纸片吸收一定浓度的药物,经干燥或不经干燥,放入涂布 了菌悬液的平板上,一般9厘米的培养皿中等距放置三片 为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈,抑菌圈内出现的 可能就是抗性菌。
基本理论:代谢途径、基因重组规律的标记菌种。 应用研究:生产核苷酸、氨基酸,工程菌株的亲本。
④营养缺陷型的筛选方法
第一步:诱变剂处理 第二步:淘汰野生型
抗生素法(细菌)、菌丝过滤法(真菌)
第三步:检出缺陷型 夹层培养法、限量补充培养法(观大小) 逐个检出法(两种培养基)、影印平板法 第四步:鉴定缺陷型
常见的致变剂及其致变作用
(a)亚硝基的脱氨作用;(b) 烷化剂和被甲基化的碱基; (c) 5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对(A=T变G三C)。
3) 染色体畸变(chromosomal aberration)
某些强烈理化因子会引起DNA分子的大损伤(macrolesion)
染色体畸变。
既包括染色体结构上的缺失(deletion)、重复 (duplication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位
8)创造新型筛选方法
3、 三类突变株的筛选方法
1)产量突变株的筛选 如:琼脂块培养法
2)营养缺陷型突变株的筛选
①与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基
基本培养基、完全培养基、补充培养基
②与筛选营养缺陷型突变株有关的3类遗传个体
野生型(A+B+) 、营养缺陷型(A+B-)、原养型(A+B+)
③营养缺陷型突变株的应用
出现明显降低其死亡率的现象,此即光复活作用。
2、切除修复(excision repair)
是活细胞内一种用于对被UV等诱变剂损伤后DNA
的修复
方式之一,又称暗修复(dark repair),这是一种 不依赖 可见光,只通过酶切作用去除嘧啶二聚体,随后重新 合成 一段正常DNA链的核酸修复方式。
第二节 诱发突变及诱变剂
1)碱基的置换(substitution )
转换(嘌呤间或嘧啶间) 颠换(嘌呤和嘧啶间)
亚硝酸引起的使A︰T转换成G┇C 过程的简式见下图
HNO2
A:T
He:T
Hk+T
第一次复制
A┇ T Hk┇C
第二次复制
G┇C Hk┇C
①直接引起置换的诱变剂
②间接引起置换的诱变剂
2)移码突变(frame-shift mutation)
• 平皿快速检测法
平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基 平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产 量性状转化成可见的“形态”变化。 纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生 长圈法和抑制圈法等。——定性或半定量 用 ,大大提高筛选的效率 ——初筛
微生物特异性平板检测方法
饱浸含某种指示 剂的固体培养基 的滤纸片变色圈
1)背景辐射和环境因素的诱变;
2)微生物自身有害代谢产物的诱变效应;
3)互变异构效应;(配对错误) 4)环出效应。(发生缺失)
(六)紫外线对DNA的损伤及其修 复
嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物
(六)紫外线对DNA的损伤及其修复
1、光复活作用(photoreactivation)
把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时, 就可
常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
目的:淘汰大量野生型,使营养缺陷型占的比例增加
• 进一步检出所需缺陷型
逐个检出法
影印培养法
夹层培养法
一般从菌落大小也可 以判断,新长出的菌 落较小,即是营养缺 陷型
• 营养缺陷型的鉴定 获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。
出来
二、突变体的筛选
(一)随机筛选
(二)根据菌落特征或生化反应筛选 (三)冷敏感菌筛选法 (四)梯度平板法 (五)营养缺陷型菌株的筛选
菌种筛选的策略 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求
初筛:要力求快速、简便 复筛:应该做到精确,测得的数据要能够反映将来的生产水平
(1)从菌体形态变异分析——初筛 有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性,在筛 选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。
某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长 因子、碱基或氨基酸的能力,因而无法再在基本培养基上正常
生长繁殖的变异类型。
2、抗性突变型(resistant mutant)
指野生型菌株因发生基因突变,而产生的对某化学药物或
致死物理因子的抗性突变类型。
3、条件致死突变型(conditional lethal mutant)
第九章 微生物的突变和诱变育种
第一节 微生物的突变
第一节
微生物的突变
一、基因突变(gene mutation) 基因突变简称突变,是变异的一类,泛指细胞内(或病 毒粒内)遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变 化,可自发或诱导产生。突变的几率一般很低(10-6
~
10-9)
从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株(wild type
strain),简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状 的菌株,称突变株(mutant,或突变体、突变型)。
(一)突变类型
凡能用选择性培养基(或其他选择性培养条件) 快速选择出来的突变株称选择性突变株 (selectable mutant),反之则称为非选择性突
变株。
1、营养缺陷型(auxotroph)