单细胞全基因组测序

单细胞全基因组测序

单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。

从方法学角度来看，获得高覆盖率高保真性的全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)利用随机引物和等温扩增可以获得高保真的DNA大片段，但该方法的主要缺陷在于非平衡的基因组覆盖率、扩增偏倚、嵌合序列及非特异扩增等[1]。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题。另外，还有科研人员利用DOP-PCR进行全基因组扩增(whole-genome amplification，WGA)及DNA测序对单个乳腺癌细胞进行了拷贝数变异的分析，进而推断出细胞的群体结构和肿瘤的进化过程。但是由于该方法的基因覆盖率较低，而且不能在单个核苷酸的分辨率上评价单个肿瘤细胞的遗传学特征，故并不能检测在肿瘤发展过程中发挥重要作用的单个核苷酸的改变。2012年，哈佛大学谢晓亮院士在《Science》发表了单细胞全基因组扩增新技术MALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，简称MALBAC），即多次退火环状循环扩增技术[2][3]。不同于以往的非线性或指数型扩增方法，MALBAC技术利用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而很大程度上防止了DNA的指数性扩增，从而解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，并使基因组测序的模板需求量从µg级降至单细胞水平。MALBAC技术原理如下：

图1：MALBAC技术原理

MALBAC Primers having a 27-nt common sequence followed by eight random nucleotides are annealed to the genomic DNA template. Strand-displacement synthesis generates partial amplicons, which are subsequently denatured from the template at 94°C. Priming to new positions on the genomic DNA template generates more partial amplicons, which increases coverage of the genome with a resulting reduction in amplification bias. Priming nad extension on the partial amplicons yield complete amplicons having the MALBAC primer sequence at 5’ end and its complementary sequence at the 3’ end. Denaturation at 94°C regenerates the original template and a now larger and more diverse pool of partial amplicoms. Full amplicons form loops, which may be resistant to subsequent amplification and hybirdization. Full amplicons are generated for eight cycles and the exponentially amplified by about 14-21 cycles using primers complementary to the common region of the MALBAC primers.

常见的全基因组扩增方法(whole-genome amplification，WGA)比较如下：

表1：常见WGA方法比较

WGA方法MALBAC MDA DOP-PCR PEP

最低DNA模板量0.5pg，单细胞或单染色体1000pg 1000pg 1000pg

基因组覆盖度～90％[2]～70％～40％～50％

Allele dropout概率<10％高达50％——

扩增前后的偏倚倍数 2 19.861.8220.5

适宜的下游应用二代测序，芯片检测，

qPCR，CNV分析，SNP分

析，常规PCR

常规PCR，二代测序常规PCR 常规PCR

不适宜的下游应用无CNV分析CNV分析，二代测序，

芯片检测，qPCR CNV分析，二代测序，芯片检测，qPCR

通过比较我们发现，MALBAC技术具有如下优势：

1）降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。

这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。

2）灵敏度高：单细胞、单染色体或0.5pg的基因组DNA即可进行扩增。

3）扩增均匀性显著优于其它技术，测序数据可进行CNV分析，用于21三体等染色体变异检测。

4）扩增产物用途广泛：可用于二代测序、微阵列、qPCR、基因克隆。

目前，MALBAC技术现在已经成功应用于人类单精子、植入前产前筛查的囊胚和极体、早期发育胚胎、肿瘤细胞、刑侦现场痕量物证和部分微生物。

参考文献

[1] Yilmaz S, Singh AK. Single cell genome sequencing. Curr Opin Biotechnol 2012; 23(3): 437-43.

[2] Zong CZ, Lu SJ,Chapman AR,Xie XS. Genome-Wide Detection of Single Nucleotide and CopyNumber

Variations of a Single Human Cell. Science 2012;338(6114):1622-6.