Western实验步骤
Western实验步骤
转染（24-well）步骤1、贴壁细胞，0.5×105/500μl无抗生素培养基2、0.8μgDNA加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)3、2μl Lipofctoomine TM2000加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)，室温5min4、混合后室温20min共100μl5、每孔加100μl，混匀6、37℃培养18-48h，4-6h是更换培养基型号总体积DNA Lipo200096-well 100μl 0.2μg 0.5μl24-well 500μl 0.8μg 2μl6-well 2ml 4.0μg 10μl60-mm 5ml 8.0μg 20μl10-cm 15ml 24μg 60μlWestern Blot步骤一、蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取（Monolayer adherent cells）:1、倒掉营养液，用冰预冷的PBS洗三次，弃净PBS后把培养皿置于冰上（期间标记EP管，用冰）2、1ml三去污裂解也加7μl PMSF（苯甲基磺酸氟）、1μl aprotinin(抑肽酶)、1μl leupetin（亮氨酸）、1μl pepstain(胃酶抑素)摇匀置于冰上。
也可以用冰冷PBS转移至EP管离心后再裂解，可操作性更强。
用量：6孔板每孔25μl，60mm2平皿70μl。
用过的scraper先用75%乙醇洗，再用超纯水洗3、在冰上用塑料细胞刮刮下贴壁细胞，用加样器吸至EP管中，4℃冰箱中震荡15分钟4、于4℃下12000rpm离心30min（提前开离心机预冷）5、将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中放于-20℃保存（2）组织中总蛋白的提取1、将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
裂解完一管先用75%乙醇洗，再用超纯水洗，最后用吸水纸吸干。
western 实验步骤
Western Blot 实验基本步骤一、原理Western blotting（免疫印迹）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应飞抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体其反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
Western blot实验步骤及注意事项
Western blot实验步骤及注意事项一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
western实验步骤
1．蛋白样品的制备在50mg组织中加入0.5ml蛋白裂解液(50mM Tris.Cl pH 6.8、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5% NP-40、1mM PMSF)，超声匀浆，10000g ,4℃离心10min,取上清，加入等体积的2×SDS buffer（tris-Cl 100mM, DTT 200 mM, 甘油20%，溴酚蓝0.2%, SDS 4%），95℃煮沸5min, 迅速冰浴，10000g ,4℃离心10分钟，收集上清，用于后面实验。
2． SDS-PAGE（1）分离胶12%Tris-HCl PH 8.8 2.5ml双蒸水 3.3ml10%SDS 0.1ml30%丙烯酰胺 4.0ml10%过硫酸铵 0.1mlTEMED 0.04ml（2）浓缩胶5%Tris-HCl PH 6.8 0.63ml双蒸水 3.44ml10%SDS 0.05ml30%丙烯酰胺 0.83ml10%过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.0005ml（3）电泳：浓缩胶恒压80V, 时间约45分；分离胶恒压120V，时间约3小时。
3．转膜（1）PVDF膜（millipore,K9KN1973U）的活化：甲醇浸泡2分，蒸馏水1分，转入转移缓冲液中。
（2）转移仪进行转膜：恒流200mA, 2小时。
4．封闭：5%BSA溶液, 4℃封闭过夜。
5.一抗孵育：（1）抗体稀释度：鼠源beta-actin, 1:1000稀释,鼠源chop, 1:1000稀释,兔源p38，1:1000稀释，稀释液：TBST。
（2）时间：4℃过夜。
6.二抗孵育：（1）抗体稀释度：抗鼠二抗或抗兔二抗, 1：10000稀释。
（2）时间：室温2h。
7. ECL(pierce,KL140454)底物化学发光显色，显影，定影，扫描。
Western超详细实验步骤
Western实验步骤1。
电泳(Electrophoresis）（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS—PAGE凝胶进行配制,配方试剂去离子水，Arc—HCL（29:1)，10%APS,SDS，TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12％-15％的胶，浓缩胶10％的胶。
配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml—10ml)3。
加水压胶，待分离胶凝固后(可见有分离胶与水有分隔线,一般凝固时间30分钟—1小时左右），吸走上层水面4。
按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子,（注意别有气泡)，待凝.（如果今日不上样可以放入4°C冰箱)注意:玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好,不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；(2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3。
5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰,蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟,以充分变性蛋白。
3。
12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后,直接上样到SDS—PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker （6ul)(注意上样蛋白质顺序,一定不要弄错)。
3。
通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳.(为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上.3.转膜（Transfer）1。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
western实验操作原理及方法
蛋白免疫印迹（Western blotting）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。
二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
此反应大约2 min即可完成，并可稳定1小时。
2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate, (NH4)2S2O8, APS）或核黄素（ribofavin, VB2）和加速剂N, N, N’,N’-四甲基乙二胺（N, N, N’,N’-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。
* Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。
浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。
3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。
三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，12000rpm 1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。
2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。
10 mL M-PER或T-PER+50μL 200 mM Na3VO4+50μL 200 mM PMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物）3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1小时。
4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35%超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡）5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1 h，max speed。
western步骤详解
序号试剂名称1 硝酸纤维膜(NC膜) 0.45um2 三羟甲基氨基甲烷（Tris）3 甘氨酸4 甲醇5 盐酸（HCl）6 氯化钠7 Tween-208 脱脂奶粉9 丽春红S10 乙酸11 DAB12 30%过氧化氢13 1N盐酸3'3'二氨基联苯胺4盐酸盐14(4-CN)三、仪器和器具：1.转印电泳装置；2.稳流稳压电泳仪；3.高速冷冻离心机；电子天平；电冰箱；4.玻璃平皿、水槽、搪瓷盘5.微量进样器（5-50ul/20-200ul/100-1000ul）；6.普通试剂瓶、棕色试剂瓶（10ml/100ml/1000ml）7.烧杯(50ml/250ml/2000ml)、玻璃吸管及玻璃棒8.滤纸、玻璃纸、小刀片等四、溶液配制：1.10×转膜缓冲液（10×Transfer buffer）：Tris 29 g甘氨酸144g，去离子水加至800ml，4℃保存。
使用时取80ml上述溶液，加入500ml去离子水，200ml甲醇，用浓盐酸调PH至7.6，去离子水定容至1000ml2.10×TBS：Trise-base 24.2 gNaCl，85g用适量去离子水溶解，用1N盐酸调节PH至7.6，去离子水定容至1000ml，。
3.洗涤液（TBS/T）10×TBS 100 mlTween-20 1 ml去离子水定容至1000ml4.封闭液脱脂奶粉5.0g（溶解于80ml去离子水中）10×TBS 10 mlTween-20 50 ul去离子水定容至100ml5.10×丽春红S储存液丽春红S 2 g三氯乙酸30 g磺基水杨酸30 g去离子水溶解并定容至100 ml。
丽春红S染液（备选）丽春红S 0.2 g1%(V/V)乙酸100ml6.Tris-HCl（0.1M，PH7.5）Tris 21g溶于80ml去离子水中，用1N盐酸调节PH至7.5，去离子水定容至100 ml。
western 一抗,二抗以及显色实验步骤
一抗处理（his-tag抗体）①用平头镊子将PVDF膜夹至小饭盒中（蛋白面朝下），加适量PBS缓冲液，将小饭盒置于摇床上，摇晃五分钟。
再重复两次。
②称取牛血清蛋白40mg溶于2mlPBS中，配成浓度为2%的溶液。
③将PVDF膜轻轻夹取到密封的小袋中，加入②中配好的溶液，排去气泡，封好袋口。
将小袋子放在小饭盒中，冰浴摇晃1h。
④按稀释倍数为1:1000将适量的his-tag抗体加入小袋中，轻轻混匀，封好袋口。
（无需换袋，直接加入即可，此次试验我们加入了2μl抗体）⑤将装置放在摇床上，冰浴，过夜处理。
二抗处理（辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG）①用PBS洗一抗后的膜，每次5分钟。
再重复两次②以二抗抗体：PBS=1:1000的比例配好二抗体系③用平头镊子将PVDF膜放入干净，密封性良好的小袋中，加入二抗体系，轻轻混匀，排去气泡，封上袋口。
④将装置放在摇床上，冰浴，摇晃2h。
DAB辣根过氧化物酶显色①用PBS洗二抗后的膜，每次5分钟。
再重复两次②按照DAB显色液A：DAB显色液B=1:1的比例配制成DAB染色工作液。
③最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，将蛋白面朝上置于干净的保鲜膜上，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。
④室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。
⑤去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。
⑥显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。
BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)染色①用PBS洗二抗后的膜，每次5分钟。
再重复两次②用平头镊将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。
③按BeyoECL Plus A液：BeyoECL Plus B液=1:1的比例配置BeyoECL Plus工作液。
④根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml BeyoECL Plus工作液的比例，滴加BeyoECL Plus工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1-2分钟。
western实验步骤
【实验步骤】1 试剂的配制1.1 30%丙烯酰胺（29:1）的配制（1）称取丙烯酰胺（Acrylamide）29g、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide）1g，置于100ml的烧杯中；（2）向烧杯中加入双蒸水约60ml，充分搅拌溶解，倒入量筒中；（3）加入双蒸水定容至100ml，用0.45μm滤膜滤去杂质；（4）置于棕色瓶中4℃保存，备用。
1.2 电泳缓冲液的配制（1）取Tris 3.0g、甘氨酸14.4g、10%SDS 10ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.3 电转缓冲液的配制（1）取Tris 3g、甘氨酸14.4g、甲醇200ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，然后倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.4 TBST的配制（1）取1M Tris-Cl（PH7.4）20ml、氯化钠8.775g、吐温-20 0.5ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，然后倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶（12%）的成分（15ml）双蒸水 4.9ml30%丙烯酰胺（29:1）6ml1.5M Tris-Cl（PH8.8） 3.8ml10%SDS 0.15ml10% AP 0.15mlTEMDE 6μl （2）浓缩胶的成分（5ml）双蒸水 3.4ml30%丙烯酰胺（29:1）0.83ml1.0M Tris-Cl（PH6.8）0.63ml10%SDS 0.05ml10% AP 0.05mlTEMDE 5μl1.6显影液的配制将小袋药粉先溶于约50℃适量温水中，完成溶解后再将大袋药粉加入至全溶，按照溶水量冷却至20℃使用。
Western+实验操作程序
Western blot 实验操作程序一、储存液的配制：1.)1.5M T ris-HCl（PH8.8）：100mlTris 18.15g去离子水50 ml缓慢加浓盐酸调PH至8.8（约4 ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml.2.) 0.5M T ris-HCl（PH6.8）：100mlTris 6.05g去离子水50 ml缓慢加浓盐酸调PH至6.8（约8ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml..3.)10%SDS（W/V）：100mlSDS 10g去离子水100 ml溶解后，室温下保存。
4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油50 ml去离子水50 ml 混匀后，室温下保存。
5. )1%溴酚蓝：10 ml溴酚蓝100mg去离子水10ml搅拌至完全溶解，经过滤后使用6. )丽春红S(Ponceau S)储存液：100 ml丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g去离子水100ml混匀后，室温下保存。
7. )10×转膜液：1000 ml甘氨酸90gTris 19.3g加去离子水至1000 ml，PH在8.3-8.4左右.二、工作液的配制：PMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。
它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成10 mg/ml的储存液，需用异丙醇溶解）。
Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。
丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。
搅拌至完全溶解，在4o C下可保存数月。
4. 4⨯分离胶缓冲液：100 ml2M Tris-HCl（PH6.8）75 ml 1.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水21ml混匀后可在4o C下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4⨯的缓冲液即可5. 4⨯堆积胶缓冲液: 100 ml1M Tris-HCl（PH6.8）50 ml 0.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水46ml混匀后可在40C保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4⨯的缓冲液即可6. 10%过硫酸胺(APS)：5 ml过硫酸胺0.5g去离子水5ml分装后，保存于-200C7. 电泳缓冲液:1000 mlTris 3g 25 mM甘氨酸14.4g 192 mMSDS 1g 0.1%加去离子水至1000 ml，PH在8.3左右。
western 实验
1）总蛋白提取①在直径6 cm的培养皿种细胞，待细胞长至贴满皿低70-80%时加药，培养规定时间后，弃掉培养基，用预冷PBS洗涤2次；②每个皿中加入180 μl中强度的RIPA裂解液（于4℃融化后加入1%的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF），摇晃培养皿，使裂解液均匀布满整个皿底，注意整个过程在冰上进行；③约30 min后，用细胞刮刀将培养皿中的细胞裂解液刮到一起，再用移液器移入预冷的1.5 ml离心管中，4℃12,000 rpm离心15 min，取上清液，保存于-80℃备用。
3）蛋白定量(酶标仪，这个仪器Biotek的单功能酶标仪，伯托也有，看老师经常做什么实验，再根据预算选择)①按照10：1混合BCA A液和B液配制成BCA工作液，按照两倍关系梯度稀释蛋白标准液（1 mg/ml）至10 μg/ml，将待测样品稀释1-15倍；②96孔板中，每孔加入200 μl BCA工作液，再加入20 μl稀释过的待测样品以及标准品，设置3-5个复孔，以及调零孔，37℃摇床中孵育30 min；③待恢复室温后，用酶标仪562 nm波长处测定吸光值，记录数据；④根据数据计算出标准曲线，以及蛋白样品的浓度，并用PBS将所有样品浓度统一。
1）为了使蛋白完全变性，在上述蛋白溶液中加入5×蛋白上样缓冲液（按照4：1的比例混合）后在沸水中煮3-5 min；2）SDS-PAGE蛋白电泳（电泳仪，这个仪器咱公司不卖，北京六一比较有名，是个国产厂家）①洗净的灌胶板晾干后，固定在灌胶架上，注意一套灌胶板一定要对齐并且左右水平的夹入灌胶夹里，防止漏胶；②按照凝胶配方，根据待测蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶，灌注时移液器一定要紧贴一侧，缓缓灌入防止压入气泡，然后在上层未填满处缓缓加入异丙醇避免冲击尚未凝结的凝胶溶液；③待胶完全凝结后，吸出异丙醇，并且用去离子水轻轻清洗残留的异丙醇；④按照凝胶配方配好浓缩胶后，参照②中方法灌入分离胶上方，并且插入梳子（注意：插入时先将一边完全插入然后再插另一边，防止进入气泡）；⑤待浓缩胶也完全凝结后，拔出梳子，从灌胶架上取下上述胶板，放入蛋白电泳槽中，加入电泳液，每孔上样量控制在25-40 μg范围内，且每孔加入等体积的样品；⑥首先恒压65 V使样品在浓缩胶中到达统一水平位置，在样品即将进入分离胶时将电压上调至120 V，通常约1.5 h后溴酚蓝到达凝胶最底部，则停止电压；3）转膜（仪器：iblot，Life的，）①从胶板中取出凝胶，将浓缩胶和底部溴酚蓝处切掉，并浸泡到预冷的转膜液中，同时剪取一张与凝胶大小一致的PVDF膜浸入无水甲醇中活化5 min，并转入预冷转膜液中备用；②在槽心夹板里从黑色负极面向无色正极依次放入海绵垫、浸泡过转膜液的三层滤纸、凝胶、PVDF膜（注意：凝胶和PVDF膜之间一定不能有气泡出现）、三层滤纸，海绵垫，然后关闭夹板，放入转膜槽里（注意：黑面对负极，透明面对正极）；③在恒流200 mA条件下转膜1.5-2 h（目标蛋白为COX-2、PINK1时转膜2 h，LC3时转膜1.5 h）；④取出PVDF膜，置入丽春红染色液中3-5 min，用去离子水漂洗去浮色后，观察转膜效果；4）杂交（此过程用到的仪器就是摇床）①用封闭液对转膜良好的PVDF膜进行室温1 h封闭处理；②将封闭后的PVDF膜置于一抗中，4℃孵育过夜，然后将一抗吸掉，用TBST洗涤PVDF膜三次，每次约5 min；③将PVDF膜置于二抗中，室温孵育1 h，然后将二抗吸掉，用TBST洗涤PVDF 膜三次，每次约5 min；5）曝光（这步传统上是在暗室曝光，可给老师推荐咱们PS的FC系列的凝胶成像）①按照说明书，配制定影液、显影液、以及ECL发光液；②本步骤在暗室中进行，首先在暗盒里铺一层保鲜膜，然后用镊子夹出PVDF 膜，并停滞数秒，去除部分膜上残留的TBST，然后浸润到ECL发光液中，数秒后取出，置于暗盒里的保鲜膜上，缓缓晃匀PVDF膜上残留的发光液，再将一层保鲜膜盖在PVDF膜上，在待测条带的位置上压X-胶片，根据条带亮度，在1 s-20 min之间调整曝光时间，随后，将胶片依次放入显影液、定影液中，最后用清水冲洗，晾干；6）扫描与分析胶片经过扫描后，条带灰度由Image J软件分析。
western实验步骤与注意事项
葵花宝典致亲爱的师弟师妹：本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写一二。
一、来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住，以及实验室里有什么仪器！！！二、关于实验部分1、组织蛋白提取：方法一：（1）4℃下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液，剪刀剪碎，匀质器6000，循环六次，每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后14000转，20min，4℃（2）跑western之前，需测BCA，以保证每个组分上样的蛋白总质量一样（此处为定量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA）注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行（包括管底小尖尖），且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。
方法二：（1）取冰（东边实验室，最后面有制冰机）（2）将软骨从﹣80℃冰箱取出，置于冰面上解冻（3）去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内，（4）转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨（5）浆糊状，立即转入EP管中，（6）细胞裂解液，2、western blotting（1）抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下.2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。
一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。
比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学，负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了（2）β-actin（内参蛋白）分子质量为43KD，因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致，内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有β-ACTIN，GAPDH等。
WESTERN详细实验步骤
前期准备物品准备：平皿、眼科剪、小镊子、匀浆器、研磨器、枪头（10ul、100ul、1000ul）、EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（提蛋白的所有操作均在冰上）、超纯水、脱脂奶粉、热水/水浴缸。
配液准备：PBS液：PBS 1袋，2000ml超纯水。
（最好加热促溶，并提前消毒，4℃过夜备用）TBST液（洗膜液）：PBS液：Tween20=1000:1电泳缓冲液：Tris base 3.01g，甘氨酸 18.77g，SDS 1g，超纯水1000ml。
转膜液（1L）：Tris base 3.03g，甘氨酸 14.4g，超纯水 800ml，甲醇200ml。
封闭牛奶：脱脂牛奶 5g，TBST 100ml。
丽春红：考马斯亮蓝：化学发光底物（1ml）：A液、B液各0.5ml。
（B液需避光保存）SDS-PAGE 分离胶（一般选8%）：10%SDS用前先加热溶解；AP配成10%（1mlAP+10ml超纯水）分离浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 18% 20% 8% 10% 12% 15% 18% 20% H20 ml 4.63 4 3.3 2.3 1.3 0.63 6.9 5.9 4.9 3.4 1.9 0.930%丙烯酰胺2.673.3 4 5 6 6.67 4 5 6 7.5 9 101.5MTRIS-HCL(ph8.8)2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.810%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 AP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15TEMED 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul总体积（ML ）10ml 15mlSDS-PAGE 浓缩胶：操作步骤肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP 管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作试剂浓度5%H20 ml 2 3 4 6 30%丙烯酰胺 0.5 0.75 1 1.5 1.5MTRIS-HCL(ph8.8)0.5 0.75 1 1.5 10%SDS 40 60 80 120 AP 30 45 60 90 TEMED 4ul 6ul 8ul 12ul 总体积（ML ）3ml4.5ml6ml9ml均在冰上）1、取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状；2、加入组织裂解液约500ul（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20～30min；3、吸取组织液到已高压灭菌的EP管中，4℃离心，12000rpm×15min；4、取出EP管放在冰盒内，仔细吸取上清，取2ul的上清用于蛋白浓度的测定；5、剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min；6、瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。
western实验步骤
western实验步骤Western实验步骤西方实验法（Western blotting）是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来检测目标蛋白在复杂混合物中的存在以及其相对丰度。
本文将介绍Western实验的步骤。
1. 样品制备需要从细胞或组织中提取蛋白质。
可以使用细胞裂解液或蛋白质提取缓冲液来裂解细胞，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，使用离心等方法将细胞碎片与其他细胞组分分离。
最后，将得到的蛋白质溶液进行浓缩和纯化，以获得高质量的蛋白样品。
2. SDS-PAGE电泳将样品中的蛋白质按照其分子量大小通过SDS-PAGE电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在加热后进行电泳。
电泳时，将样品注入凝胶孔中，并在电场作用下进行分离。
蛋白质在凝胶中的移动速度受到其分子量的影响，较小的蛋白质迁移得更远。
电泳结束后，用染色剂染色来可视化蛋白带。
3. 转膜将电泳后的蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便进行后续的免疫检测。
通常使用半干法或湿法转膜的方法。
在半干法中，将电泳片与膜和吸收纸堆叠在一起，用电流将蛋白质转移到膜上。
在湿法中，将电泳片和膜分别浸泡在缓冲液中，并通过电流进行转膜。
转膜完成后，可以通过Ponceau染色来验证转膜效果。
4. 阻断和抗体处理为了减少非特异性结合，需要在膜上进行阻断处理。
常用的阻断剂包括非脂类干乳或BSA。
将膜浸泡在阻断液中，以阻断未结合的蛋白质结合位点。
然后，将膜与目标蛋白特异性的一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验的目的和样品的特点来确定。
将膜与抗体孵育一段时间后，用缓冲液洗涤膜以去除未结合的一抗。
5. 二抗检测在处理完一抗后，需要使用与一抗来源物种不同的二抗来检测目标蛋白的存在。
二抗一般是与酶或荧光标记结合的抗体。
将膜与二抗进行孵育，并再次用缓冲液洗涤膜以去除未结合的二抗。
然后，使用适当的检测方法来可视化目标蛋白。
6. 结果分析根据实验目的和所用的检测方法，可以使用化学发光、荧光成像或酶标记等技术来检测和量化目标蛋白的存在。
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
western 实验操作流程
免疫印迹实验操作流程一、培养细胞总蛋白质的提取1. 每200ul预冷的RIPA裂解液中加入2ul PMSF，混匀后置冰上备用；2. 收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸干上清；3. 每106个细胞加100ul预冷的RIPA裂解液，与细胞充分混匀，置4℃条件下放置30m，每间隔5分钟吹打混匀；4. 4℃，12000rpm条件下离心5m，将上清转移入另一预冷的离心管中；5. 使用蛋白定量试剂盒及酶标仪对总蛋白质进行定量测定；调整蛋白浓度；6. 依据体积加入6×蛋白上样缓冲液（如不立即使用，置于-80℃待用）；沸水浴煮沸5分钟后准备上样。
二、电泳与转膜7. 清洗玻璃板，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%分离胶和5%积层胶）；8. 蛋白提取液与预染蛋白分子量Marker上样，100V电泳；9. 依据实验要求剪出合适大小的PVDF膜，甲醇漂洗PVDF膜10s，并使用电转液完全浸润PVDF膜、胶板、海绵、滤纸15m；10. 剥胶后，根据预染蛋白分子量Marker确定目的条带的位置并切胶；11. 按阴极至阳极：海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将转膜板固定于装满电转液的电转槽中，90V电转；12. 电转结束后，在膜上做标记；三、封闭、一抗与二抗孵育、显色13. 将膜条置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温缓慢振荡封闭1h；14. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗中：抗β-actin小鼠抗人单克隆抗体（1:4000），置4℃条件下缓慢振荡过夜（或室温振荡2h以上）；TBST 液洗膜三次，每次10min；15. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的二抗中：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1:4000），室温缓慢振荡1h；TBST液洗膜三次，每次10min；16. 加入配制好的化学发光试剂ECL，室温2min后，X光片曝光、显影、定影。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
western试验步骤及注意事项
western试验步骤及注意事项W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm 的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。
待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5?样品缓冲液，以1?样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。
（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。
（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟? 3次。
（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
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Western实验步骤
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X 的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。
电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。
为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。
硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
转膜时也可以使用碧云天
的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
在整个Western 过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗。
用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
回收一抗。
加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128)，进行内参检测。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。
碧云天有多种二抗提供。
用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
加入Western洗涤液(P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白。
压片可以采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。
如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片(FF057/FF081)。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。