毕赤酵母表达从入门到提高
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二、 毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式
通过转化 DNA 与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。这些 重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有 HIS4 基 因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在 AOX1 或 his4 位点进行同源重组，从而产生 HIS+ 重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点
在YPD培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为 2h Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的 存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为 4 至 6 个小时 存在甲醇的情况下，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为 18 个小时
1) 具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2) 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3) 营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4) 可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达 120g/L 以上； 5) 表达量高，许多蛋白可达到 g/L 以上水平； 6) 在 P. pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与 S. cerevisiae 相比，P. pastoris 不产生过度的糖基化。P. pastoris 表达的糖蛋白的糖链长度为
8-14 个甘露糖，而 S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达 50-150 个；S. cerevisiae 分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有
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终端 α-1，3 糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强，而 P.pastoris 的糖基化位点与哺乳类细胞的相同， 其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。 2. 毕赤酵母常用的菌株类型 2.1Mut+和Muts 在毕赤酵母基因组中有 2 个醇氧化物酶编码基因，即AOX1 基因和AOX2 基因。菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1 基因表达的AOX1 蛋白，其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1 酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2 酶蛋白，这就 是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Muts产生的原理。当菌株基因组中既有AOX1 基因，也有AOX2 基因时，菌株的 表型为Mut+ 该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。当菌株基因组中仅有AOX2 基因时，菌株的表型为Muts，该菌株 在有甲醇的培养基中生长缓慢。 2.2 菌株 GS115、KM71 和 SMD1168 的区别 GS115、KM71 和SMD1168 等是用于表达外源蛋白的酵母受体菌。GS115、KM71、SMD1168 是组氨酸缺陷型， 如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些 受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-8。GS115 表型为Mut+ 。重组表达载体转化GS115 后，长出的转化 子可能是Mut+，也可能是Muts，可以在MM 和MD 培养基上鉴定表型。SMD1168 和GS115 类似，但SMD1168 是蛋白 酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71 没有AOX1 基因，本身就是Muts。因此转化后所有的转化子都 是Muts，不必鉴定表型。 3. 毕赤酵母菌株的生长 毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30 度，温度超过 32 度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。关于毕赤 酵母的生长速度:
Kex2 蛋白酶切割的位置在信号肽序列中精氨酸和谷氨酸连接处：
Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala
“*”位置为 Kex2 蛋白酶切割位点。
Ste13 蛋白酶切割的位置在信号肽序列中谷氨酸和丙氨酸重复处：
Glu-Ala*-Glu-Ala*
“*”位置为 Ste13 蛋白酶切割位点。
以 pPICZα 为例，想表达天然 N 端重组蛋白请使用 XhoI 切点并用 PCR 重建从 XhoI（1184-1189）开始到编码精氨
限制酶
插入事件
GS115表型
KM71表型
SalI或StuI
插入his4
His+Mut+
His+Muts
SacI
插入5’AOX1
His+Mut+
His+Muts
BglII
取代 AOX1
His+Muts
His+Muts（不推荐）
2. 转化方法
几种酵母转化方法的比较
转化方法 原生质体法 电击转化 PEG1000 LiCl
http://helixnet.cn/bbs/forumdisplay.php?fid=55
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图 1 重组质粒插入 3’AOX1 2. 基因替换 AOX1 位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交换事件(取代)，结果AOX1 编码区全部 被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的 Mut 表型。基因取代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达盒。基因取代 （双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。
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总第 20 期
毕赤酵母表达从入门到提高
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本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等 来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的 复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。若本文侵犯了您的版权或有任何不妥， 请Email：kaosy@163.com告知。此外，由于学识、经验有限，本文难免会存在一些错误或缺陷， 敬请不吝赐教，联系方式：kaosy@163.com同时因存在环境、试剂、仪器以及人为等原因，不能 保证实验 100%的成功，仅供参考。
GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动子，AOX1 转录终止子TT或下 游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插 入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。
转化效率(per μg) 105 105 103 102
方便因素 低 高 高 高
多拷贝整合 可以 可以 无 无
附英文原版以防我翻译的可能不准（Pichia Protocols 28 页） 3. 毕赤酵母的电击感受态的制备及电击转化 (1) 感受态的制备：
a) 挑取酵母受体菌的单菌落接种于 10mLYPD 培养基中，30℃摇床过夜。 b) 以 1 %接种量转接 100mLYPD 液体培养基，30℃摇床过夜至 OD=1.3-1.5。 c) 4℃离心 5000rpm,5min,弃上清。 d) 用 100mL 冰预冷无均水将菌体重悬。 e) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。 f) 用 50mL 冰预冷无均水将菌体重悬。 g) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。 h) 再用 20mL 1 mol/L 的山梨醇洗涤 1 次 i) 溶于 200uL 1mol/L 的冰预冷的山梨醇，以备转化 很多朋友问，感受态做好了可以在-80 度放么? 在这里我给出我自己的一点实验心得，酵母感受态尽量要现用现做，因为转化的效率有很大的影响，我现做的感受 态的转化效率最高阳性率约为 20%左右，以前不是使用现做的感受态一般的阳性率在 1%-2%。很多朋友说自己的阳性率 比较低，可以考虑一下是不是感受态的问题。 (2) 毕赤酵母的转化 在 80μl 酵母感受态细胞中加入用合适酶切位点线性化的质粒 1-5μg 冰上放置 15 分钟，迅速加入 0.2cm 电击杯中（冰 预冷），电击，迅速加入山梨醇，涂板。感受态尽量现用现做，电击以后直接涂板，不需要活化。 一般在 MD 上 3-4 天会长出肉眼可见的菌落，在 RDB 上需要 4-5 天可以长出肉眼可见的菌落。至此感受态及转化已 经完成。 在这里我要强调一下重组质粒的含量一定要在 1-5μg，而且越高越好，越纯越好。我一般在酶切以后，将切好的基因 片段用乙醇沉淀后溶于 10μl 待转化就好。线性化质粒的含量也对转化效率有很重要的影响，切记。很多找不到阳性重组 子的朋友，可以考虑一下是不是这个问题。 4. 原生质体方法转化毕赤酵母 (1)原生质体方法转化毕赤酵母原理
三、 毕赤酵母表达重组载体的构建
1． 表达载体的选择 根据基因的表达定位及目的可以简单的将毕赤酵母的表达载体主要分为以下几类：
(1) 胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。该 类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。
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酸（1193-1195），以保证重组蛋白被有效切割。在成功表达重组蛋白以后需要对其进行 N 端测序来最后确定其是否正确
切割。
四、 几种酵母转化方法的比较
1. 线性化
http://helixnet.cn/bbs/forumdisplay.php?fid=55
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酵母转化的第一步是做线性化，不同的酶可以产生不能的效果，常用的酶主要有以下四个，产生的表型如下：
(2) 分泌型表达载体主要有 pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P 等。由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外 源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。常用的分泌的信号序列主要是由 89 个氨基酸组成的 α
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图3 质粒插入形成双拷贝HIS4/his4 基因 4. 多拷贝插入
尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，还是很容易在转化子中筛选到插入多 拷贝的表达核的转化子。其插入示意图如下：
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交配因子(α- factor)的引导。 (3) 多拷贝插入表达载体如 pPIC9K，pPIC3.5K。在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表
达量。该载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加 重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可 通过连接产生外源基因的串联插入。 2．如果想要表达的重组蛋白具有天然的 N 端，应该将克隆的基因直接连接在 Kex2 蛋白酶的切点后
写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可 以让大家理解一些不常见的符号及意义。下载地址如下： http://www.helixnet.cn/bbs/thread-19215-1-1.htmL
一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达 系统。目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台， 相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。 1.主要优点
图2AOX1 位点的基因被取代 3. 基因插入His4位点
GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之间发生单交换事件，结果在his4位点 插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株 相同。
通过转化 DNA 与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。这些 重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有 HIS4 基 因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在 AOX1 或 his4 位点进行同源重组，从而产生 HIS+ 重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点
在YPD培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为 2h Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的 存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为 4 至 6 个小时 存在甲醇的情况下，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为 18 个小时
1) 具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2) 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3) 营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4) 可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达 120g/L 以上； 5) 表达量高，许多蛋白可达到 g/L 以上水平； 6) 在 P. pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与 S. cerevisiae 相比，P. pastoris 不产生过度的糖基化。P. pastoris 表达的糖蛋白的糖链长度为
8-14 个甘露糖，而 S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达 50-150 个；S. cerevisiae 分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有
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终端 α-1，3 糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强，而 P.pastoris 的糖基化位点与哺乳类细胞的相同， 其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。 2. 毕赤酵母常用的菌株类型 2.1Mut+和Muts 在毕赤酵母基因组中有 2 个醇氧化物酶编码基因，即AOX1 基因和AOX2 基因。菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1 基因表达的AOX1 蛋白，其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1 酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2 酶蛋白，这就 是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Muts产生的原理。当菌株基因组中既有AOX1 基因，也有AOX2 基因时，菌株的 表型为Mut+ 该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。当菌株基因组中仅有AOX2 基因时，菌株的表型为Muts，该菌株 在有甲醇的培养基中生长缓慢。 2.2 菌株 GS115、KM71 和 SMD1168 的区别 GS115、KM71 和SMD1168 等是用于表达外源蛋白的酵母受体菌。GS115、KM71、SMD1168 是组氨酸缺陷型， 如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些 受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-8。GS115 表型为Mut+ 。重组表达载体转化GS115 后，长出的转化 子可能是Mut+，也可能是Muts，可以在MM 和MD 培养基上鉴定表型。SMD1168 和GS115 类似，但SMD1168 是蛋白 酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71 没有AOX1 基因，本身就是Muts。因此转化后所有的转化子都 是Muts，不必鉴定表型。 3. 毕赤酵母菌株的生长 毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30 度，温度超过 32 度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。关于毕赤 酵母的生长速度:
Kex2 蛋白酶切割的位置在信号肽序列中精氨酸和谷氨酸连接处：
Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala
“*”位置为 Kex2 蛋白酶切割位点。
Ste13 蛋白酶切割的位置在信号肽序列中谷氨酸和丙氨酸重复处：
Glu-Ala*-Glu-Ala*
“*”位置为 Ste13 蛋白酶切割位点。
以 pPICZα 为例，想表达天然 N 端重组蛋白请使用 XhoI 切点并用 PCR 重建从 XhoI（1184-1189）开始到编码精氨
限制酶
插入事件
GS115表型
KM71表型
SalI或StuI
插入his4
His+Mut+
His+Muts
SacI
插入5’AOX1
His+Mut+
His+Muts
BglII
取代 AOX1
His+Muts
His+Muts（不推荐）
2. 转化方法
几种酵母转化方法的比较
转化方法 原生质体法 电击转化 PEG1000 LiCl
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图 1 重组质粒插入 3’AOX1 2. 基因替换 AOX1 位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交换事件(取代)，结果AOX1 编码区全部 被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的 Mut 表型。基因取代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达盒。基因取代 （双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。
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毕赤酵母表达从入门到提高
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GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动子，AOX1 转录终止子TT或下 游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插 入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。
转化效率(per μg) 105 105 103 102
方便因素 低 高 高 高
多拷贝整合 可以 可以 无 无
附英文原版以防我翻译的可能不准（Pichia Protocols 28 页） 3. 毕赤酵母的电击感受态的制备及电击转化 (1) 感受态的制备：
a) 挑取酵母受体菌的单菌落接种于 10mLYPD 培养基中，30℃摇床过夜。 b) 以 1 %接种量转接 100mLYPD 液体培养基，30℃摇床过夜至 OD=1.3-1.5。 c) 4℃离心 5000rpm,5min,弃上清。 d) 用 100mL 冰预冷无均水将菌体重悬。 e) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。 f) 用 50mL 冰预冷无均水将菌体重悬。 g) 4℃离心 5000rpm,10min,弃上清。 h) 再用 20mL 1 mol/L 的山梨醇洗涤 1 次 i) 溶于 200uL 1mol/L 的冰预冷的山梨醇，以备转化 很多朋友问，感受态做好了可以在-80 度放么? 在这里我给出我自己的一点实验心得，酵母感受态尽量要现用现做，因为转化的效率有很大的影响，我现做的感受 态的转化效率最高阳性率约为 20%左右，以前不是使用现做的感受态一般的阳性率在 1%-2%。很多朋友说自己的阳性率 比较低，可以考虑一下是不是感受态的问题。 (2) 毕赤酵母的转化 在 80μl 酵母感受态细胞中加入用合适酶切位点线性化的质粒 1-5μg 冰上放置 15 分钟，迅速加入 0.2cm 电击杯中（冰 预冷），电击，迅速加入山梨醇，涂板。感受态尽量现用现做，电击以后直接涂板，不需要活化。 一般在 MD 上 3-4 天会长出肉眼可见的菌落，在 RDB 上需要 4-5 天可以长出肉眼可见的菌落。至此感受态及转化已 经完成。 在这里我要强调一下重组质粒的含量一定要在 1-5μg，而且越高越好，越纯越好。我一般在酶切以后，将切好的基因 片段用乙醇沉淀后溶于 10μl 待转化就好。线性化质粒的含量也对转化效率有很重要的影响，切记。很多找不到阳性重组 子的朋友，可以考虑一下是不是这个问题。 4. 原生质体方法转化毕赤酵母 (1)原生质体方法转化毕赤酵母原理
三、 毕赤酵母表达重组载体的构建
1． 表达载体的选择 根据基因的表达定位及目的可以简单的将毕赤酵母的表达载体主要分为以下几类：
(1) 胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。该 类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
酸（1193-1195），以保证重组蛋白被有效切割。在成功表达重组蛋白以后需要对其进行 N 端测序来最后确定其是否正确
切割。
四、 几种酵母转化方法的比较
1. 线性化
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酵母转化的第一步是做线性化，不同的酶可以产生不能的效果，常用的酶主要有以下四个，产生的表型如下：
(2) 分泌型表达载体主要有 pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P 等。由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外 源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。常用的分泌的信号序列主要是由 89 个氨基酸组成的 α
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图3 质粒插入形成双拷贝HIS4/his4 基因 4. 多拷贝插入
尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，还是很容易在转化子中筛选到插入多 拷贝的表达核的转化子。其插入示意图如下：
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达量。该载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加 重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可 通过连接产生外源基因的串联插入。 2．如果想要表达的重组蛋白具有天然的 N 端，应该将克隆的基因直接连接在 Kex2 蛋白酶的切点后
写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可 以让大家理解一些不常见的符号及意义。下载地址如下： http://www.helixnet.cn/bbs/thread-19215-1-1.htmL
一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达 系统。目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台， 相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。 1.主要优点
图2AOX1 位点的基因被取代 3. 基因插入His4位点
GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之间发生单交换事件，结果在his4位点 插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株 相同。