致泻大肠埃希式菌的检验
致泻大肠埃希氏菌
3.
生化反应
生化反应十分活泼，是鉴定肠道菌的重要 依据。 乳糖发酵试验在初步鉴别肠道致病和非致 病菌时有重要意义，肠道致病一般不分解乳 糖，而非致病菌多数能分解乳糖。
鉴定中最重要的生化反应
乳糖发酵试验
肠道非致病菌（埃希菌属） 发酵乳糖、产酸产气＋
肠道致病菌（志贺菌属、
沙门菌属等）不发酵乳糖 —
4. 抗原构造复杂
在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑浊，而 后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。
培养特性
部分菌落可出现β溶血。 在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落。
在SS琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌
也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落。
在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落。
在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色。
肠产毒性大肠埃希氏菌 （Enterotoxigenic E. coli,ETEC）
引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻， 也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性， 一般2-3天即愈。致病因素是LT或ST，或两者 同时致病。有些菌株具有定居因子，常见者 为O6：K15：H16、O25：K7：H42。鉴定ETEC 主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参 考意义。
分类
肠杆菌科
埃希氏菌属
大肠埃希氏菌
致泻大肠埃希氏菌
肠道致病性大 肠埃希氏菌 EPEC
肠道出血性大 肠埃希氏菌 EHEC
产肠毒素大肠 埃希氏菌 ETEC
肠道侵袭性大 肠埃希氏菌 EIEC
致泻大肠埃希氏菌
致泻性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化 特性均与非致病的大肠埃希氏菌非常相似，以至难 以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差 异来区别。 在致泻性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人 的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感 染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害 畜牧业，降低畜产食品的质量。致泻性大肠埃希氏 菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其 人畜粪便污染的各种食品中分离出来。
致泻大肠埃希式菌的检验
❖ 1、学习掌握致泻性大肠埃希氏菌检验的基本原理 和方法；
❖ 2、了解动物性食品检验致泻性大肠埃希氏菌的意 义。
二、 生物学特性
俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周生鞭
毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长
普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli 扫描照片
2、分离培养 ❖ 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌
液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板；
❖ 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。
❖ 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
EMB培养基
菌落特征：黑紫色或紫红 色，圆形，边 缘整齐，表面 光滑，湿润， 常具有金属光 泽，也有的呈 紫黑色，不带 或略带金属光 泽。
OK多价2 O26：K60（B6） O125：K70（B15） O126：K71（B16） O128：K67（B12） OK多价3 O44：K74（L） O114：K90（B） O119：K69（B14） O142：K86（B）
大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分 解乳糖，不产生H2S。
靛基质试验：细菌分解蛋白质中的色氨酸产 生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成 玫瑰吲哚而成红色。
❖ 脲酶试验：细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基 pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲 酶。
❖ 动力试验：有动力的细菌会沿着穿刺线扩散生长。
❖ 当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清 所包含的单价O血清做试验。
❖ 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群。如与某一 单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。
致病性大肠埃希氏菌及其检验
致病性：（1）致 病因素
LT与ST的比较
特性
分子量 耐热性 免疫原性 B亚单位受 体
致病机理
不耐热肠毒素
耐热肠毒素
较大，73000
较小，1500-5000
不耐热
耐热
有
无
肠黏膜GM1神经节苷酯 肠黏膜GM1神经节苷酯
活化细胞腺苷酸环化酶，活化细胞鸟苷酸环化酶，
细胞内cAMP含量升高， 细胞内cGMP含量升高，
原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂。 大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，故可染上酸性染料伊红，又因 伊红与美兰结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群产生带 核心的、有金属光泽的深紫色的（龙胆紫的紫色）阳性菌落，从菌 落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典 型菌落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。 有的由于被检样品影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、 湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。
革兰氏阴性杆菌
革兰氏 阳性杆 菌
大肠杆菌扫 描电镜照片源自大肠杆菌 透射电镜 照片大肠杆菌革兰氏染色照片
大肠杆菌平 板菌落照片
一、埃希氏菌属生物学特性
生化特性
一．可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或 迟缓发酵乳糖；
二．不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致; 三．本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。 四．不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（二）、分离培养
将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦 康凯或伊红美兰琼脂平板上。 2、于36±1℃培养 18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按 划线法接种，不经过增菌过程。不但要注意乳糖发酵 的菌落，同时也要注意乳糖不发酵的菌落。
大肠埃希氏菌生化鉴定结果
大肠埃希氏菌生化鉴定结果大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，可以引起多种感染性疾病，包括腹泻、尿路感染和食物中毒等。
鉴定大肠埃希氏菌的生化特征可以帮助确定病原菌的身份以及其潜在的耐药性和毒力因子。
本次实验目的是对一株致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，以确认其菌株的性质和特征。
首先，我们进行了气体产生实验。
在Triple Sugar Iron Agar（TSI）培养基中，观察到菌落周围发生了气体产生，此结果表明该菌株具有产气性。
产气性通常意味着大肠杆菌等需要葡萄糖产生酸，进而分解产生气体的细菌。
其次，我们进行了甲烷发酵试验。
在Methyl Red（MR）试剂中，当菌液发酵产酸时，溶液颜色由黄色变成红色。
然而，该菌株在MR试剂中没有产生红色反应，这表明它无法通过甲烷发酵产酸。
这一结果与典型的大肠杆菌不同，因为大肠杆菌通常可以通过此途径产酸。
进一步，我们进行了亮氨酸脱氨酶试验。
使用亮氨酸脱氨酶（LDC）培养基，如果菌株具有亮氨酸脱氨酶活性，菌液会变色。
然而，我们观察到该菌株在培养基中没有出现任何颜色变化，这表明它不具备亮氨酸脱氨酶活性。
亮氨酸脱氨酶活性通常是大肠杆菌的典型特征之一。
此外，我们还进行了尿素酶试验。
使用尿素平板培养基，如果菌株具有尿素酶活性，培养基颜色将由黄色变为粉红色。
然而，我们观察到该菌株在培养基上未显示出任何颜色变化。
这暗示着该菌株可能缺乏尿素酶活性，与大肠杆菌的典型特征不同。
最后，我们进行了青霉素酶试验。
使用青霉素酶试纸进行反应检测，在试纸上出现蓝色点状斑点表示菌株具有青霉素酶活性。
而对于这个菌株，我们观察到在试纸上没有出现蓝色斑点。
这意味着该菌株可能对青霉素类药物敏感，这对于抗生素选择治疗提供了重要信息。
综上所述，通过对致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，我们发现该菌株具有产气性，但与典型的大肠杆菌不同，它不表现出甲烷发酵、亮氨酸脱氨酶和尿素酶活性。
志贺氏菌和致泻大肠埃希式菌的检验
葡萄糖半固体原理及结果。 三糖铁（TSI）琼脂试验的原理
2－志贺氏菌 3－沙门氏菌
4－大肠杆菌 Organism Test Result
1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假 单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
2、分离培养 • 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌 液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板； • 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。 • 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
大肠杆菌在麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）的特征
四、微生物学检验
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→伊红 美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定 →血清学鉴定→ 肠毒素鉴定→报告
1、增菌培养 • 以无菌手续称取检样25 g，加在225 mL营 养肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加 灭菌砂磨碎。 • 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定 大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶 内，于36±1℃培养6 h。 • 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉 汤内，于 42℃培养 18 h。
量及剩余体质量,二者之比大于0.09阳性,0.070.09为可疑.
6、结果报告 • 根据以上生化试验、血清学试验和肠毒素试验结 果作出报告。 • 如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结 果； • 如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验 结果。
2、分离培养 • 强选择性平板：SS或HE • 弱选择性平板：麦康凯或无色透明，中等大小，光滑圆形菌 落
基于多重PCR_检测食品中致泻大肠埃希氏菌
分析检测基于多重PCR检测食品中致泻大肠埃希氏菌谭 波，黄坤宁*（贵州省检测技术研究应用中心，贵州贵阳 550014）摘 要：目的：提高实验室对食品中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）的检测能力与检测效率，验证DEC多重PCR试剂盒的适用性。
方法：依据《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》（GB 4789.6—2016）分离鉴定样品23-H770、23-X371，用DEC多重PCR检测试剂盒检测5种DEC的12条特征基因。
结果：23-H770未检出DEC，23-X371检出STEC/EHEC，阴、阳性对照菌种均检出GB 4789.6—2016中5种DEC目标条带与型别对照表相应基因条带，且空白对照12条目标基因条带均未检出。
结论：能力验证样品评价结果为“满意”，多重PCR检测试剂盒能快速准确检测EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC和EAEC。
关键词：多重PCR；致泻大肠埃希氏菌；电泳；检测Detection of Diarrheogenic Escherichia coli in Food Based onMultiplex PCRTAN Bo, HUANG Kunning*(Guizhou Testing Technology Research and Application Center, Guiyang 550014, China) Abstract: Objective: To improve the detection capability and efficiency of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) in food, and to verify the applicability of DEC multiplex PCR kit. Method: Samples 23-H770 and 23-X371 were isolated and identified according to GB 4789.6—2016, and 12 characteristic genes of 5 species of DEC were detected with DEC multiple PCR detection kit. Result: DEC was not detected in 23-H770, STEC/EHEC was detected in 23-X371, and GB 4789.6—2016 were detected in all the five DEC target bands and corresponding gene bands in the genotype comparison table, while none of the 12 target gene bands were detected in the blank control. Conclusion: The evaluation result of ability verification sample is satisfactory. The multiplex PCR kit can detect EPEC, EIEC, ETEC, STEC/EHEC and EAEC quickly and accurately.Keywords: multiplex PCR; diarrheagenic Escherichia coli; electrophoresis; detection致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）是一类可引起人体腹泻症状的大肠埃希氏菌（Escherichia coli），常见的DEC主要有5种[1-2]。
埃希氏大肠菌及检验
埃希氏大肠菌及检验一、定义：大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。
大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。
与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。
文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。
二、生物学特性：基本形态特征：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。
此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。
约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特征：由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。
在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。
（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。
（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。
此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。
生化反应与血清学反应大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC 生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。
肠致泻性大肠埃希氏菌实验活动风险评估报告
肠致泻性大肠埃希氏菌实验活动风险评估报告肠致泻性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是一种常见的食源性致病菌，可引起腹泻疾病，包括婴幼儿腹泻和旅行者腹泻等。
为了评估ETEC实验活动的风险，以下是一份1200字以上的报告。
一、实验目的本实验旨在了解ETEC的生物学特性，研究其感染机制和毒力因子，进一步为控制和预防ETEC引起的腹泻疾病提供参考和依据。
二、实验设备和试剂1.培养细菌的培养基和试剂：如LB培养基、大肠杆菌专用试剂盒等；2. 分离和鉴定ETEC的培养基和试剂：如MacConkey琼脂培养基、乳糖和肌醇培养基、血琼脂培养基等；3.测定毒力因子的试剂：如耐酸素和耐胆盐试剂盒、PCR试剂盒等；4.实验设备：如恒温培养箱、PCR仪等；5.操作用具：如培养皿、管嘴、移液器等；6.个人防护用具：如实验室外套、手套、护目镜等。
三、实验操作流程1.分离和纯化ETEC2.培养细菌3.鉴定并筛选ETEC4.检测ETEC的毒力因子5.分析实验结果四、潜在风险和安全措施1.细菌培养和操作过程中存在生物安全风险，可能导致实验室感染。
应严格遵守实验操作规范，佩戴个人防护用具，避免直接接触细菌培养物和废棄物。
2.试剂的使用应遵循使用说明，避免接触皮肤和吸入。
如有意外接触，应立即用清水冲洗，并向医生求助。
3.实验室内应保持清洁整洁，并进行定期消毒，以防止细菌污染和交叉感染。
4.实验室应设置生物安全柜，保证实验操作的无菌环境。
5.实验室工作人员应进行相关安全培训，了解应急处置措施和实验室紧急撤离计划。
五、应急处置措施1.如实验过程中发现细菌培养物泄漏或感染，应立即采取隔离措施，通知实验室负责人，并进行相应的消毒和清理。
2.如有人员接触细菌培养物或试剂导致皮肤或黏膜受伤，应立即用清水冲洗，并及时向医生求助。
3.如实验过程中发生火灾、泄露气体等紧急情况，应立即采取逃生措施，按照实验室紧急撤离计划进行撤离，并向实验室负责人报告。
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验(三)
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验（三）5.4.1 沙门氏菌分型鉴定按GB4789.4举行。
假如判定为时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。
5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定 5.4.2.1 按GB4789.6和GB4789.36举行。
分别的菌株应当同时被同样的几个噬菌体裂解后，用分型噬菌体实验，这些菌株应当具有相同的裂解模式，同时测定IRTD噬菌体的裂解状况。
5.4.2.2 ，应有肠毒素实验的证明。
5.4.2.3 侵袭性大肠埃希氏菌，典型的生化特性为：实验阴性、无动力、产气或不产气(O124血清型亦可以为有动力、不产气)，靛基质实验阳性。
可进一步做豚鼠角膜实验，结果应当为阳性，质粒电泳应证实具有120～140MdaI大质粒，PCR实验证实具有ipaC或ipaH基因。
5.4.2.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌O157:H7,典型的生化特性为：乳糖、蔗糖产酸，产酸并多数产气，阴性，靛基质阳性，山梨醇迟缓发酵。
PCR实验证实具有产志贺毒素基因strl,stx2和溶血毒素基因hly。
IRTD的E-2噬菌体裂解实验，能被IRTD的E-2噬菌体裂解(裂解程度包括从CL到少数几个噬斑)。
对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌，根据5.4.2.3的程序举行鉴定。
5.4.2.5 肠道致病性大肠埃希氏菌具有大肠埃希氏菌的典型生化特性，eαe基因(黏附屏蔽基因)的PCR实验为阳性。
产志贺毒素大肠埃希氏菌eαe实验也可为阳性。
EAF(黏附因子质粒基因)或物(菌毛捆绑形成基因)的PCR实验可进一步证明。
5.4.3 志贺氏菌分型鉴定 5.4.3.1 挑取上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集实验。
血清学分型鉴定结果见表3。
表3 噬菌体实验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的结果 5.4.3.2 如按噬菌体裂解模式结果为福氏志贺氏菌1～5型，先用福氏多价血清做凝集实验。
致泻大肠埃希氏菌检验标准
致泻大肠埃希氏菌检验标准
1. 范围
本标准规定了致泻大肠埃希氏菌检验的术语和定义、通用要求、样品采集与处理、实验室基本要求、检验程序、结果报告、记录和档案管理等要求。
本标准适用于食品、水源等样品的致泻大肠埃希氏菌检验。
2. 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
GB 4789.16 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
3. 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 致泻大肠埃希氏菌Escherichia coli causing diarrhea
能够引起人类腹泻症状的大肠埃希氏菌。
4. 通用要求
4.1 实验室应建立完善的生物安全制度，保证工作人员的安全和防护。
4.2 实验室应配备相应的仪器设备和试剂，保证检验的准确性和可靠性。
4.3 实验室应按照相关规定做好废弃物的处理和消毒工作，防止污染环境和危害人员健康。
5. 样品采集与处理
5.1 样品采集
5.1.1 食品样品：采集具有代表性的食品样品，包括原材料、半成品、成品等。
5.1.2 水源样品：采集具有代表性的水源样品，包括自来水、饮用水、地表水等。
5.2 样品处理
5.2.1 食品样品：将样品无菌包装或以其他方式保证无菌操作，避免交叉污染。
211148708_国内外致泻大肠埃希氏菌O157
Quality Control国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议孟 静，钟立霞，郭颖慧，程祥龙，伊廷存，霍胜楠*山东省食品药品检验研究院，山东济南 250100摘 要：致泻大肠埃希氏菌O157:H7（STEC O157:H7）是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌，主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中，对身体健康造成很大危害，甚至引发死亡。
食品中STEC O157:H7检测尤为重要。
本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较，提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强，以便为该菌快速准确检测提供帮助，实现与国际标准化体系建设接轨，满足实验室检测需要。
关键词：致泻大肠埃希氏菌（STEC O157:H7）；检验检测；国内外对比文章编号：1671-4393（2023）04-0076-07 DOI:10.12377/1671-4393.23.04.120 引言致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌，可污染食物引起发病。
O157:H7是其中一种血清型，能分泌志贺毒素，一旦感染，主要引发血性腹泻[1，2]，严重的可发展为溶血性尿毒症综合征[3，4]、出血性结肠炎和永久性器官衰竭[5]，这类产志贺毒素大肠埃希氏菌称为肠道出血性大肠埃希氏菌（STEC）。
感染STEC O157:H7的主要来源是食物，一般存在猪肉、禽肉、牛肉、牛奶、果汁、冷三明治、蔬菜和饮水等。
流行暴发大多因为食用被该菌污染的食物或未严格消毒饮用水。
STEC O157:H7还能通过人与人接触传播[6，7]。
由于食品基质复杂性、致病菌种类及污染途径，产品存在风险，新发布的《GB 29921—2021 食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》将牛肉制品、预切蔬菜水果等产品增加致泻大肠埃希氏菌的检测作者简介：孟 静（1979-），女，河北晋州人，硕士，正高级工程师，研究方向为食品检验检测；钟立霞（1989-），女，山东临朐人，硕士，工程师，研究方向为食品检验检测；郭颖慧（1989-），女，山东济南人，硕士，高级工程师，研究方向为食品检验检测；程祥龙（1992-），男，山东临沂人，硕士，工程师，研究方向为食品检验检测；伊廷存（1982-），男，山东蒙阴人，硕士，高级工程师，研究方向为食品安全检验检测技术研究。
致病性大肠埃希氏菌及其检验
5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可见β溶血环。 6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落 7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌， 也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落； 8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金属光泽的菌 落 9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色 •
埃希氏菌在S．S琼脂平板上形成红色菌落
• 在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌 大肠埃 希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基 是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和pH指 示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变 红。（麦康基琼脂，18小时，37℃）
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性杆菌
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
大肠杆菌革兰氏染色照片
致病性大肠埃希氏菌的检验
（四）血清学试验 • 假定试验： 从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病 性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒 素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌 O157血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做 阴性报告。当与某一种多价O血清凝集时,再与该 多价血清所包含的单价血清做实验,如与某一种单 价O血清呈现强烈的凝集反应,即为假定实验阳性. 不凝集的培养物可做阴性报告。
一、埃希氏菌属生物学特性
致病性：（2）所致疾病 • 肠外感染：泌尿系统感染最常见病原菌。还可引 起胆囊炎、肺炎、新生儿或婴儿脑膜炎。 • 腹泻：产毒素大肠杆菌是婴儿及旅游者腹泻的主 要原因；致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要原因； 侵袭型大肠杆菌主要引起较大儿童和成年人腹泻。
一、埃希氏菌属生物学特性
C-枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
• 利用枸橼酸盐生长 + • 不能利用 •
致泻大肠埃希氏菌
ETEC
157
171
766
EAEC
102已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔 1 环～2 环，至装有 1 mL0.85%灭菌 生理盐水的 Eppendorf 管内，混匀。4 ℃～8 ℃，12 000 r/min 离心 15 min，弃去上清。沉 淀加入 100 µL 灭菌去离子水中，混匀。100 ℃煮沸 12 min，12 000 r/min 离心 5 min，上清 即为 PCR 扩增模板，可直接用于 PCR 反应。 8.4 多重 PCR 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重 PCR 扩增加样体系见表 5。PCR 反应条件：预变 性 94 ℃ 5 min。变性 94 ℃ 30 s，复性 63 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1.5 min，30 个循环。最 后 72 ℃延伸 5 min。
致泻大肠埃希氏菌检验标准操作程序
本操作程序规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。 本操作程序适用于食品中致泻大肠埃希菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：0～4℃。 2.2 恒温培养箱：36± 1℃。 2.3 恒温水浴锅：44.5± 0.2℃。 2.4 显微镜：10-100× 。 2.5 均质器。 2.6 天平，感量为 0.1g。 2.7 灭菌广口瓶：500mL 或无菌均质袋。 2.8 灭菌锥形瓶：500mL，250mL。 2.9 灭菌吸管：1mL(具 0.01mL 刻度)、5mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。 2.10 灭菌培养皿：直径 90mm。 2.11 灭菌试管：10mm× 75mm。16mm× 160mm。 2.12 1.5 mL Eppendorf 管。 2.13 全自动微生物生化鉴定系统。 2.14 PCR 仪。 2.15 电泳仪。 2.16 凝胶成像系统。 3 培养基和试剂 3.1 EC 肉汤：见附录 A 中 A.1。 3.4 麦康凯琼脂（MAC）：见附录 A 中 A.2。 3.5 伊红美蓝琼脂(EMB)：见附录 A 中 A.3。 3.6 三糖铁琼脂(TSI)：见附录 A 中 A.4。 3.7 营养琼脂斜面：见附录 A 中 A.5。 3.8 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.6。 3.9 尿素琼脂(pH7.2)：见附录 A 中 A.7。 3.10 蛋白胨水（靛基质试验）：见附录 A 中 A.8。 3.11 半固体琼脂：见附录 A 中 A.9。 3.12 革兰氏染色液：见附录 A 中 A.10。
食品致泻大肠埃希氏菌检验原始记录
食品致泻大肠埃希氏菌检验原始记录
样品编号：检验开始时间：年月日
样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：致泻大肠埃希氏菌检测依据：GB4789.6-2016
无菌操作称（量）取固体或半固体样品25g加入225ml营养肉汤均质杯中；液体量取25mL 装入225mL营养肉汤的无菌锥形瓶中（可加适量玻璃珠），36±1℃培养6h；取10μL接种于肠道增菌肉汤管内，于42±1℃培养18h。
将增菌液划线接种于MAC和EMB营养琼脂平板，于36±1℃培养18~24h
观察菌落形态，挑取可疑菌落在做生化鉴定及PCR确认试验。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。
电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：。
致泻性大肠埃希氏菌PCR多重检测方法建立
致泻性大肠埃希氏菌PCR多重检测方法建立目前国内检测致泻大肠埃希氏菌的现行有效方法是GB/T 4789.6-2003，该方法主要从分离培养、生化试验、血清学试验和肠毒素试验对致泻性大肠埃希氏菌进行鉴定，本方法虽然不需要贵重仪器设备、费用低，但是耗时较长，实验所用的试剂不易买到，实验过程干扰因素较多。
由于该类菌与普通大肠埃希氏菌生化反应相似，在分离平板上菌落形态近似，因此从平板上反应上挑取可疑菌落就很困难，只有多挑取可疑菌落进行下一步的鉴定才能增加样品中检出致泻性大肠埃希氏菌的几率。
而多挑取菌落进行鉴定又增加了人力物力的消耗。
由于致泻性大肠埃希氏菌包含5种，因此对挑取的单个菌落要同时进行EPEC,ETEC,EIEC,EHEC 和EAEC的检测，半轴繁琐，复杂。
分子生物学尤其是PCR方法以其快速、简便，灵敏度高，特异性强等特点，越来越多的应用于病原体毒力基因的检测，而大肠埃希氏菌的致泻性主要取决于是否携带相应的独立因子，因此该技术特别是多重PCR技术特别适合于5种致泻大肠埃希氏菌多种毒力基因的检测。
多重PCR技术，可以在一个反应体系中进行多个目的基因片段的PCR扩增，快速获得致病菌种属、型别和毒力基因的扩增结果。
美国早在2008版BAM上将PCR检测技术应用到致泻性大肠埃希氏菌的鉴定。
近年来，许多学者进行了该方面的研究，但仅限于一种致泻大肠的毒力基因和种属基因的检测，而同时对五种致泻大肠埃希氏菌进行鉴定的多重PCR试剂盒未见报道。
天津生物芯片开发的五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒通过同步扩增致泻性杆菌菌典型毒力基因，快速实现对EPEC/ EHEC/ ETEC/ EIEC/ EAEC等五种致泻性大肠埃希氏菌的型别划分和鉴定。
【预期用途】用于食品、饮用水、临床样品以及环境样品中的五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）的分型检测。
【检验原理】五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。
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• 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群。如与某一 单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性 。
2020/6/4
多价血清 单价血清
单价血清
单价血清
单价血清
OK多价1
O55：K59（B5 ）
O86：K61（B7）
O111：K58（B4）
• 动力试验：有动力的细菌会沿着穿刺线扩散生长。 • 赖氨酸脱羧试验：细菌从赖氨酸脱去羧基（-COOH
），导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显 示出蓝色，试验结果为阳性，如果细菌不能脱酸， 培养基不变则为黄色。
2020/6/4
4、血清学试验
• 假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的 琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大 肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O 血清 和出血性大肠埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集试 验。
2020/6/4
EMB培养基
菌落特征：黑紫色或紫红 色，圆形，边 缘整齐，表面 光滑，湿润， 常具有金属光 泽，也有的呈 紫黑色，不带 或略带金属光 泽。
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3、生化检验 • 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁
琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这 些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2 尿 素琼脂、KCN 肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。 以上培养物均在 36℃培养过夜。 • TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,KCN 阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌.
大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分 解乳糖，不产生H2S。
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靛基质试验：细菌分解蛋白质中的色氨酸产
生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成 玫瑰吲哚而成红色。
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• 脲酶试验：细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基 pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲 酶。
• 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定 大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶 内，于36±1℃培养6 h。
• 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉 汤内，于 42℃培养 18 h。
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2、分离培养 • 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌
液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平 板； • 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线 接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培 养18～24 h，观察菌落。 • 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
报告。
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普通大肠埃希氏菌Escherichia Co 污染水源和土壤，进而污染食物 • 肉类食品 • 乳制品 • 水产品等
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四、致病性
• 肠道内感染 腹泻、食物中毒、肠热症
• 肠道外感染 鼠疫（烈性传染病）、泌尿道感染、 肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症
• TSI底层不产酸或 H2S、KCN、尿素有任何一项 为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。
• 必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。
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• 三糖铁琼脂试验：只能利用葡萄糖的细菌 ，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但 因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧 化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生 成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部 由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所 以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌，则产 生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。细 菌分解含硫氨基酸，产生H2S，与FeSO4发 生反应形成FeS。
O127a：K63（B8 ）
OK多价2
O26：K60（B6 ）
O125：K70（B15 ）
O126：K71（B16 ）
O128：K67（B12 ）
OK多价3
O44：K74（L ）
O114：K90（B）
O119：K69（B14 ）
O142：K86（B）
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5、结果报告 • 根据以上生化试验和血清学试验结果作出
致泻大肠埃希氏菌及其检验
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一、目的与要求
• 1、学习掌握致泻性大肠埃希氏菌检验的基本原理 和方法；
• 2、了解动物性食品检验致泻性大肠埃希氏菌的意 义。
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二、 生物学特性
俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周生鞭
毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长
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五物 、学 微检 生验
检样
乳糖发酵阳性 的发酵管
25g+营养肉汤225mL
36℃±1℃
6h
麦康凯 EMB
36℃±1℃ 18h~24h
肠道菌增菌肉汤
乳糖发酵或不发酵的菌落3个~5个， 氧化酶—，革兰氏阴性杆菌
TSI、靛基质、pH7.2尿素 KCN、赖氨酸、动力
TSI底层+， H2S—，
KCN—，尿素—
血清学试验
非左述的各种 反应结果
非大肠埃希氏菌
2020/6/4
报告
（一）检验步骤 检样→样品处理→增菌培养→伊红
美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定 →血清学鉴定→报告
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1、• 以增无菌菌培手养续称取检样25 g，加在225 mL营养 肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加灭 菌砂磨碎。