CDA1基因原核(PET-22b)表达论文

CDA1基因的原核(PET-22b)表达摘要：本实验通过构建cda1基因与pet－22b载体的重组体，成功地使其在大肠杆菌bl21中进行原核表达，并对表达后的产物做分析鉴定，得出如下结果： cda1重组蛋白分子量约为47kd；重组质粒pet22b-cda1的表达产物以包涵体形式存在。结论：实验成功构建了原核表达载体pet22b-cda1，并获得重组cda1蛋白。

关键词：原核表达；甲壳素脱乙酰酶；cda1；重组质粒

前言

甲壳素的生物合成和分解代谢是在甲壳素相关酶的催化下进行的。这些酶存在于动物、植物和微生物中，在生物体内控制着各种生理功能，如机体保护和支持、防御机制、致病性、消化作用和生态平衡。近几年来，对这些酶的研究日益增多并十分活跃。今天甲壳素酶学研究比起甲壳素研究中其它专题进展更快，已成为甲壳素学中的一个重要分支。

本实验选取处于对数生长期末期的毛霉，通过构建原核表达载体pet22b-cda1，诱导表达重组质粒以获得cda1重组蛋白，并对其进行相应的鉴定。

1. 方法

1.1 pet22b 质粒的获得和质粒的双酶切。使用获得的pet22b 质粒，对于试剂盒抽提所得质粒溶液，进行双酶切反应，37℃保温反应3h以上，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳后，回收、纯化双酶切的质粒片段。

1.2 重组质粒的构建。制备感受态大肠杆菌dh5α并转化将双酶切的dna片段、双酶切的质粒混合，进行连接反应。22℃反应2h

以上，转化入感受态大肠杆菌dh5α。将获得的dh5α菌液倒入含氨苄青霉素的抗性平板中。对抗性平板（不涂步iptg和x-gal）长出的单菌落进行pcr检验。

1.3 基因工程菌的构建。将含重组质粒的阳性单菌落，在抗性lb培养基中过夜培养后，抽提重组质粒，转化入感受态bl21（de3）。抗性平板上长出白色菌落，用两套不同的引物，进行pcr验证，以确定阳性菌落。从阳性菌落（bl21-重组质粒）培养液中抽提重组质粒，重新用bamhⅰ、xhoⅰ两种内切酶进行双酶切反应，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切产物。

1.4 重组质粒表达区域测序鉴定。将含有重组质粒的阳性单菌落（bl21-重组质粒）过夜培养，用8%甘油保存后送上海生工生物有限公司进行测序。对于pet22b系列重组质粒，选用：cda1基因特异性引物（cda1-sequ-r） 5’-cccaacttgcgaacagtgata-3’，反向测序，获得表达区域部分序列。

1.5 基因工程菌的诱导表达。挑取重组菌落

bl21(de3)-pet-cda1单菌落，于5ml抗性lb培养液中37℃、200rpm 培养过夜。次日吸取菌液0.5ml，加入50ml抗性lb液体培养基的锥形烧瓶中，37℃、200rpm培养2h至细菌od600约为0.6左右，采集1 ml菌液于ep管中，剩余菌液中加入iptg，诱导培养4-6h，分别于诱导后一定时间间隔，测定od600值后采集1ml菌液于ep

管中，12000rpm离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100?l 1×蛋白电泳上样缓冲液，混匀后煮沸5 min，4℃保存待用。同时以相同方法诱导表达 bl21(de3)-pet（空质粒）、bl21(de3)（不含质粒）作对照。

1.6 重组蛋白表达形式鉴定。收集10ml iptg诱导培养2-4h的细菌菌体，12,000rpm离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入1ml pbs 缓冲液，用枪头混匀重悬菌体，在冰浴中进行超声破碎。细菌破碎液以4℃、12，000rpm离心10 min，分别收集上清和沉淀；取100ul 上清液于ep管中，加入等体积2×蛋白电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，同时在沉淀中加入一定量的1×蛋白电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，用于sds-page分析重组蛋白的表达形式[李立家，2002]。

1.7 重组蛋白表达的sds-page电泳分析。参照《pet system manual》、根据诱导后不同时间采集菌体前od600值，将样品进行标准化处理，得到各样品的标准上样体积。浓缩胶（浓度是5%）电压为8v/cm，分离胶（浓度是12%）电压为15 v/cm，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源取出凝胶，以考马斯亮蓝g-250染色液室温下染色4 h，然后以脱色液平缓摇动、充分脱色后观察蛋白条带。观察、拍照并分析实验结果。

2 结果及分析

2.1 重组质粒的双酶切鉴定。实验中构建了1个重组质粒，经过双酶切反应后，电泳结果均显示了预期的一大和一小两个亮带，

其片段大小分别为>4kb和1.1-1.2kb，大片段为空质粒的双酶切产物，呈线形结构；而对照为直接抽提得到的重组质粒，片段稍大于前者，但主要呈超螺旋结构，所以两者的电泳速率仍然相当，在图中均未有明显区别。

2.2 重组质粒的测序鉴定。在得到了含pet22b-cda1重组质粒的阳性菌落后，针对其表达区域，进行了序列测定，所测得序列与对应的序列比对。密码子是由3个连续的核苷酸所组成的，代表一种氨基酸。比较发现连接了cda2-dna片段以后，氨基酸表达并未出错，接入部分前面的第598（g），599（a），600（t）个碱基所表达的氨基酸仍为天冬氨酸（asp）。由此可知，cda1基因正确地接入了表达区域，未产生移码突变。

2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳（page），是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳，在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。实验中若不加入诱导物iptg，阻遏蛋白处于活性状态，从而使重组质粒的bl21蛋白质不能表达；在诱导物iptg存在的情况下，iptg同阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白发生构象变化而处于失活状态，此时重组质粒的bl21才能够实现蛋白质表达。

3 讨论与小结

本实验把总状毛霉的cda1基因经过双酶切后接入pet22b双酶切质粒，经过pcr鉴定、双酶切鉴定及序列测定分析后表明：已成功构建了pet22b-cda1 这个重组质粒。将pet22b-cda1这个重组质