有关物质测定HPLC方法的建立

有关物质测定hplc方法的建立

一、开始之前必须明白：

1、有关物质来源的两种途径：

1）合成过程中的中间体和副产物；

2）储存过程中产生的降解产物；

2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；

3、样品中可能含有的中间体；

4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；

二、准备工作

1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。

2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。

1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；

2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；

3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。

4）分析结构。。。。。。

5）与同类产品进行比较；

三、开工（以紫外检测为例）

1、流动相的选择（采用粗品进行选择）

1）、有文献，按文献进行优化。不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。

2）、没有文献。。。。。。

a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。要是有pda检测器就不需要这一步了。

b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。

2、最低检测限

3、系统适应性试验

重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告

4、考察中间体及副产物和样品的分离度。同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。

5、考察降解产物和样品的分离情况。

这个一般是通过破坏性试验来考察。常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素

进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。

6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。现在对三批样品进行测定，通过归一化来观察，应该可以知道杂质的大概情况，根据这个可以定出相应采用自身对照法测定的杂质限量。一般情况下还应定出最大的单一杂质限量。如果样品中的杂质可以很好得到纯品，那么你就可以采用外标法来准确定量。

7、杂质的限量必须根据你的样品本身性质来定。

关于HPLC主成分自身对照法检查有关物质时检测波长确定的讨论

审评二部张玉琥

有关物质检查，包括对产品中残留合成原料、中间体、副产物及可能的降解产物的检查，是控制药品质量的重要指标，目的是检查药品中所含的上述杂质是否符合安全性的要求,同时也是药品稳定性评价中需重点考察的项目。

有关物质检查常用的方法之一是HPLC主成分自身对照法（紫外检测器），即将HPLC 色谱图中杂质峰面积与主成分自身对照液峰面积进行比较，以确定杂质限度是否合格。采用此方法时确定的检测波长是否合理直接影响到方法的可行性，因此检测波长的选择是方法学研究的重要内容。

在审评中发现一些申报单位在采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质时直接或间接地以主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。

在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有：

1．直接将主药的最大吸收波长选作检测波长。

2．简单地套用含量测定的色谱条件。在HPLC法进行含量测定时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长。若套用含量测定的色谱条件，实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检测波长。

3．以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外扫描，将扫描图谱中最大吸收波长确定为有关物质的检测波长。因破坏性试验后溶液中存在尚未破坏的主药、降解产物、辅料等，此溶液的紫外吸收为各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解产物的紫外吸收特性。由于未破坏主药所占比例较大，故破坏性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。

采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质，其前提之一是需检查的杂质与主成分在确定的检测波长下应有相近的紫外吸收（响应值接近），选择检测波长时需对产品中可能存

在的杂质（合成原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。已知杂质的紫外吸收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察，未知杂质（如未知降解产物等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况，根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的色谱条件一致。

另外，HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制。对于具有明确归属的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。对于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定，并制定严格的限度。

关于原料药有关物质检查方法建立的思考

作者: lcc666 发布日期: 2007-1-10 查看数: 73 出自:

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审评四部七室赵慧玲

【摘要】本文针对审评原料药有关物质检查方法中存在的问题，介绍欧洲和英国药

典关于原料药已知杂质的研究现状和有关物质方法建立及质量控制，以供申请人参

考。

【关键词】有关物质、方法学、分离度。

笔者审评原料药有关物质检查方法中发现，大多申请人越来越多地认识到控制原料

药有关物质的重要性，自行建立方法考察原料药中存在的有关物质。但在研究中往

往片面认为样品通过了破坏性试验和1％自身对照法后的系统适用性试验就符合了

要求。因此，忽视对主成分中杂质产生原因的分析，忽视仪器的检测灵敏度的分析、忽略色谱柱（柱效）的选择、流动相及比例的选择、检测波长的选择。忽视主成分

和可能产生的杂质分离度的问题。

原料药有关物质方法建立应关注的问题：

原料药中的杂质来源于合成的中间体、副产物、以及降解产物，建立方法初期，仅采用破坏性试验的方法考察降解产物的做法是片面的。由于降解产物的量较小，如果选择的方法不好，比如，柱效低，波长选择不合理、流动相及流动相比例不合适，即使有降解产物，也达不到有效的灵敏度和有效的分离。因此，一个好的分析方法的建立首要问题应是围绕主