基因工程菌稳定性

提高基因工程菌稳定性的策略
优化基因工程菌的培养工艺 工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大 可调控的环境参数为：培养基组分、培养温度、pH 和溶解氧浓度。 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质 粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提 高质粒的稳定性。 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高质粒稳定性的方法
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌 体的稳定性，在第二级进行表达。
基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限 制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制 性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物 的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不 同的影响
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
外源基因的表达
外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定
外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干 扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。
例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在 培养大肠杆菌 MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的 IAA，发现 随 IAA 量的增加，pVH5 带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达 水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中 Trp－ 的比例上升。电 泳分析表明 60%～70% 色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其 余是由于质粒丢失造成。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达
基因工程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
基因工程菌的稳定性
重组质粒的逃逸率
当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部 分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒 的宏观逃逸率。
重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重 组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝 数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
pH 和Biblioteka Baidu解氧
pH 和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。 pH 和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌 时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养 时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在 通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。