项目一 动物组织中核酸的提取与鉴定

第五节 蛋白质的性质
四、蛋白质的变性
– 影响因素： 影响因素：
• 温度 • 紫外线、超声波 紫外线、 • 剧烈震荡、搅拌 剧烈震荡、 • 强酸、强碱 强酸、 • 有机溶剂、表面活性剂 有机溶剂、 • 重金属盐 • 胍、尿素等
4、SOD活力测定（邻苯三酚自氧化法） 、 活力测定（ 活力测定 邻苯三酚自氧化法）
四、实验方法
3. 定性试验
– RNA的呈色反应 的呈色反应
• 支干净试管， 溶液， 取2支干净试管，一管加入 支干净试管 一管加入1.5ml RNA溶液， 溶液 另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入 另一管加入蒸馏水 ，向两管中加入3ml地 地 衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为 衣酚试剂，于沸水中加热 ， 绿色为阳性反应。 绿色为阳性反应。
六、项目总结及练习
5. 为有效去除 为有效去除RNP和DNP中的 和 中的Protein， 中的 ， 本项目采用等体积的氯仿及1/40体积 本项目采用等体积的氯仿及 体积 的异戊醇振摇30min。请问异戊醇的 的异戊醇振摇 。 作用是什么？ 作用是什么？
– 异戊醇的作用是消泡和有助于分相。 异戊醇的作用是消泡和有助于分相。
8、
金属螯合剂
（metal chelating agent） ）
• 金属螯合剂可以通过螯合剂分子与金属 离子的强结合作用， 离子的强结合作用，将金属离子包合到 螯合剂内部，变成稳定的， 螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大 的化合物，从而阻止金属离子起作用， 的化合物，从而阻止金属离子起作用， 可以用于解毒，印染，阻垢等方面。 可以用于解毒，印染，阻垢等方面。
3 0.1 1.7
3 0.1 1.7
3 0.1 1.7
室温放置20min 室温放置
邻苯三酚
0
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min， ， 加一滴浓盐酸停止反应， 测吸光值。 加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。 测吸光值
5、溶液中可溶性蛋白含量测定 、
–
•
DNA的呈色反应 的呈色反应
支干净试管， 溶液， 取2支干净试管，一管加入 支干净试管 一管加入1.5mlDNA溶液， 溶液 另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入 另一管加入蒸馏水 ，向两管中加入3ml二 二 苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变 苯胺试剂，于沸水中加热 ， 为蓝色为阳性反应。 为蓝色为阳性反应。
六、项目总结及练习
1. 从动物组织（猪肝）中提取核酸， 从动物组织（猪肝）中提取核酸， 第一步是破碎肝脏组织细胞， 第一步是破碎肝脏组织细胞，请问 破碎动物细胞的物理方法主要有哪 破碎动物细胞的物理方法主要有哪 ？（列举 列举5种 些？（列举 种）
– ①研磨法；②组织匀浆法； 研磨法； 组织匀浆法； 渗透压变动法； 超声波处理法； ③渗透压变动法；④超声波处理法； 反复冻融法等。 ⑤反复冻融法等。
六、项目总结及练习
4. RNP和DNP经0.14mol/LNaCl溶液处 和 经 溶液处 理并离心分离后， 理并离心分离后，可分别用蛋白质变 性沉淀剂来去除其中的Protein。请列 性沉淀剂来去除其中的 。 种常用的蛋白质变性沉淀剂。 举4种常用的蛋白质变性沉淀剂。 种常用的蛋白质变性沉淀剂
– 氯仿； ① 氯仿； 苯酚； ② 苯酚； ③ 十二烷基硫酸钠（SDS）； 十二烷基硫酸钠（ ） 三氯醋酸等。 ④ 三氯醋酸等。
分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各 备用的提取液、粗酶液、 分别从 按以下倍数稀释,260nm/280nm测 取0.3ml按以下倍数稀释 按以下倍数稀释 测 定吸光值,按公式计算蛋白质浓度 按公式计算蛋白质浓度. 定吸光值 按公式计算蛋白质浓度 提取液稀释:50 × 提取液稀释 粗酶液稀释:20 × 粗酶液稀释 酶液稀释:10 × 酶液稀释 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) 蛋白质浓度 ×稀释倍数
三、实验材料
• 实验器材
– 冷冻离心机（3000rpm）； 冷冻离心机（ ）； – 组织捣碎机或组织匀浆器； 组织捣碎机或组织匀浆器； – 不锈钢剪刀； 不锈钢剪刀； – 冰浴； 冰浴； – 试管、试管夹； 试管、试管夹； – 量筒、吸管； 量筒、吸管； – 带塞比色管、带塞离心管。 带塞比色管、带塞离心管。 – 玻棒、烧杯； 玻棒、烧杯； – 电炉等。 电炉等。
四、实验方法
2. 核酸的抽提
– DNA的抽提 的抽提
• 将抽提 的1mol/LNaCl匀浆悬液以 将抽提1h的 匀浆悬液以 3000rpm离心 离心20min，弃去沉淀，将其上清 离心 ，弃去沉淀， 液倒入带塞的离心管中， 液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿 体积的异戊醇振摇30min，离心 及1/40体积的异戊醇振摇 体积的异戊醇振摇 ， 20min。将其上清液加入 倍体积的冷 倍体积的冷95%乙 。将其上清液加入2倍体积的冷 乙 边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠 醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状 就缠 绕在玻棒上待定性。 绕在玻棒上待定性。 • 每次都需采用冷冻离心。 每次都需采用冷冻离心。
五、注意事项
• 在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸 在提取分离纯化核酸时， 的完整性，防止核酸变性降解， 的完整性，防止核酸变性降解，操作时 必须防止过酸或过碱。 必须防止过酸或过碱。全部过程应在低 温下(0℃左右)进行 进行， 温下 ℃左右 进行，必要时还需加入抑 制剂，以抑制核酸酶的作用。 制剂，以抑制核酸酶的作用。 • 加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不 加氯仿、异戊醇后振摇要充分， 能太剧烈，以防DNA断裂。 断裂。 能太剧烈，以防 断裂 • 要学会正确使用离心机，离心后，注意 要学会正确使用离心机，离心后， 上清液和沉淀的取舍。 上清液和沉淀的取舍。
– 在核酸提取过程中要防止核酸降解。 在核酸提取过程中要防止核酸降解。 DNA酶可降解 酶可降解DNA， 但 DNA酶的活性需要 2+ 、 酶的活性需要Mg 酶可降解 ， 酶的活性需要 Ca2+ 等金属二价离子的激活 ， 柠檬酸或柠檬酸钠 等金属二价离子的激活， 能螯合这些金属二价离子，从而抑制DNA酶的活 能螯合这些金属二价离子 ，从而抑制 酶的活 性。 与柠檬酸作用相同的物质还有EDTA、 TA等 ， 它 与柠檬酸作用相同的物质还有 、 等 们都是金属螯合剂。 们都是金属螯合剂。
–
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六、项目总结及练习
3. 猪肝经组织捣碎机破碎细胞，制得的 猪肝经组织捣碎机破碎细胞， 匀浆于3000rpm 离心 ～30min， 离心20～ 匀浆于 ， 所得沉淀用二倍体积1mol/LNaCl溶液 所得沉淀用二倍体积 溶液 抽提1h。请问什么叫抽提？ 抽提1h。请问什么叫抽提？
– 抽提是指在一定条件下， 抽提是指在一定条件下 ， 用适当的溶剂 处理， 处理 ， 使细胞破碎后的目的成分充分地 溶解到提取液中的过程。 溶解到提取液中的过程。
六、项目总结及练习
6. 在经氯仿去除蛋白质并离心后的上 清液中，加入2倍体积的冷 倍体积的冷95%乙醇， 乙醇， 清液中，加入 倍体积的冷 乙醇 低温放置15min，3000rpm离心 低温放置 ， 离心 20min，所得沉淀即为 ，所得沉淀即为RNA或DNA沉 或 沉 请问95%乙醇的作用是什么 乙醇的作用是什么？ 淀。请问95%乙醇的作用是什么？
四、实验方法
1. 制匀浆
– 将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的 0.14mol/L氯化钠溶液（内含 氯化钠溶液（ 氯化钠溶液 内含0.01mol/L柠 柠 檬酸）洗去血水， 檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成 碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的 碎块，放入组织捣碎机中加入 倍体积的 0.14mol/LNaCl溶液（内含 溶液（ 溶液 内含0.01mol/L柠檬 柠檬 制备匀浆。 酸）制备匀浆。 将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。 将匀浆置离心机中离心 （ ）。 上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体 上层液倾出留待抽提 积冷的1mol/LNaCl溶液抽提 ，待分离 溶液抽提1h， 积冷的 溶液抽提 DNA核蛋白。 核蛋白。 核蛋白
–
四、实验方法
2. 核酸的抽提
– RNA的提取 的提取
• 0.14mol/L的NaCl抽提液（内含 的 抽提液（ 核蛋白） 抽提液 内含RNA核蛋白） 核蛋白 加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带 体积的异戊醇， 加入等体积的氯仿和 体积的异戊醇 塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白 塞离心管中，振摇 ， 色混悬液， 离心15min，离心物呈 色混悬液，以3000rpm离心 离心 ， 三层。 三层。 • 用滴管吸出上层清液，在低温下加入 用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍 倍 的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置 乙醇， 的冷 乙醇 并轻轻搅拌。低温放置15min， ， 3000rpm离心 离心10min，弃去上清液，即得 离心 ，弃去上清液，即得RNA 颗粒状沉淀，待定性。 颗粒状沉淀，待定性。
三、实验材料
• 试剂
– 地衣酚（orcinol）试剂： 地衣酚（ ）试剂：
• 称取 称取100mg地衣酚溶于 地衣酚溶于100ml 浓盐酸中， 浓盐酸中， 地衣酚溶于 再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使 ， 再加入 用前新鲜配制。 用前新鲜配制。
– 二苯胺试剂： 二苯胺试剂：
• 称取 二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋 称取1g二苯胺（经重结晶）溶入 二苯胺 冰醋 酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内 摇匀， 酸中，再加入 浓 保存备用。 保存备用。
提取液、 活力。 分别检测提取液 粗酶液、酶液1、酶液2中 活力 分别检测提取液、粗酶液、酶液 、酶液 中SOD活力。
试剂/ml 试剂 pH8.3缓冲液 缓冲液 SOD提取液 提取液 蒸馏水 空白 管 OD1 对照管 提取液 OD2 粗酶液 酶液1 酶液 酶液2 酶液
3 0 2
3 0 1.8
3 0.1 1.7
项 目 一
动物组织中 核酸的提取与鉴定
一、实验目的
• 学习和掌握用盐溶法从动物组织提 学习和掌握用盐溶法 盐溶法从动物组织提
取核酸的原理和操作技术。 取核酸的原理和操作技术。 • 了解定性鉴定核酸的原理和方法。 了解定性鉴定核酸的原理和方法。
二、实验原理
• 根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白 在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解 度不同进行分离， 度不同进行分离，然后用蛋白质变 性沉淀剂去除蛋白， 性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出 来，再利用核酸不溶于乙醇的性质 将核酸析出，达到分离提纯的目的。 将核酸析出，达到分离提纯的目的。
– 核酸不溶于乙醇， 核酸不溶于乙醇 ， 乙醇主要起沉淀和除 盐作用。 盐作用。
六、项目总结及练习
7. 地衣酚又叫什么？在临床上有何用途？ 地衣酚又叫什么？在临床上有何用途？ 用其鉴定RNA的条件和原理是什么？ 的条件和原理是什么？ 用其鉴定 的条件和原理是什么
– – – 地衣酚又称苔黑酚、地衣二酚、 地衣酚又称苔黑酚、地衣二酚、3,5-二羟基 二羟基 甲苯、苔黑素等。 甲苯、苔黑素等。 临床上， 临床上，已广泛用于治疗浅层霉菌病和霉菌 性阴道炎。 性阴道炎。 RNA水解后得到核糖，在浓酸中脱水环化生 水解后得到核糖， 浓酸中脱水环化生 水解后得到核糖 成糠醛，后者与地衣酚，形成蓝绿色复合物， 成糠醛，后者与地衣酚，形成蓝绿色复合物， 处有一最大吸收峰。 在670nm处有一最大吸收峰。在一定浓度下， 处有一最大吸收峰 在一定浓度下， RNA浓度与吸光度成线性关系。 浓度与吸光度成线性关系。 浓度与吸光度成线性关系
三、实验材料
• 试剂
– – – – – 0.14mol/L氯化钠溶液 氯化钠溶液 内含0.01mol/L柠檬酸）， 柠檬酸）， （内含 柠檬酸），250ml； ； 1mol/L氯化钠溶液，250ml； 氯化钠溶液， 氯化钠溶液 ； 95%乙醇（冷）； 乙醇（ 乙醇 氯仿； 氯仿； 异戊醇。 异戊醇。
六、项目总结及练习
2. 为什么在 为什么在0.14mol/LNaCl溶液中要加 溶液中要加 0.01mol/L的柠檬酸，或者说，柠檬酸 的柠檬酸， 的柠檬酸 或者说， 或柠檬酸钠的作用是什么？ 或柠檬酸钠的作用是什么？与柠檬酸作 用相同的物质还有哪些？（最少1种 ？（最少 用相同的物质还有哪些？（最少 种）