未知基因克隆策略及进展

3、功能结合法筛选 、 适用范围： 适用范围：已知目的基因表达产物的功能 （1）噬菌体显示法（phage display） ）噬菌体显示法（ ） （2）酵母双杂交法 ） （3）酵母单杂交法 ）
（1）噬菌体显示法 ）
（2）酵母双杂交法 ）
GAL4-AD
BD UAS
GAL1-lacZ
X
BD UAS GAL1-lacZ
已知蛋白质的 表达差异
纯化的蛋白质 氨基酸序列测定
已知蛋白质功能
比较并寻找差异 比较并寻找差异 表达的 片段 表达的DNA片段
制备抗体
设计寡核苷酸探针功能结合法筛选cDNA 筛选cDNA序列 序列
（四）目的基因的确定及分析
1、DNA的顺序测定 、 了解克隆的DNA片段的 的顺序测定——了解克隆的 了解克隆的 片段的 核苷酸一级结构。 核苷酸一级结构。 2、基因顺序分析 、 （1）寻找基因的开放读框 ） （ 2）以核苷酸顺序推测相应蛋白质的氨基酸顺序 ） （ 3）根据氨基酸顺序，推测蛋白质的种类、性质、 ）根据氨基酸顺序，推测蛋白质的种类、性质、 结构、功能。 结构、功能。
GAL4-AD
X
BD UAS
Y
GAL1-lacZ
基本原理： 基本原理：
将编码某一蛋白X（诱饵 序列与DNA结 将编码某一蛋白 （诱饵bait）的DNA序列与 ） 序列与 结 合域（ 合域（binding domain，BD）的编码序列连接使其表达融 ， ） 合蛋白（ ）；将待检基因 合蛋白（BD-X）；将待检基因（Y）的cDNA与DNA激活 ）；将待检基因（ ） 与 激活 域（acting domain，AD）的编码序列连接，使其表达融 ， ）的编码序列连接， 合蛋白（AD-Y）；将两个融合基因所在载体共同转化酵 ）；将两个融合基因所在载体共同转化酵 合蛋白（ ）； 母细胞（含报告基因和上游激活序列 ）；若 与 不 母细胞（含报告基因和上游激活序列UAS）；若X与Y不 ）； 能相互作用，则不表达报告基因； 能相互作用， 能相互作用，则不表达报告基因；若X与Y能相互作用， 与 能相互作用 则使BD和 靠近形成有效的转录激活子 靠近形成有效的转录激活子， 则使 和AD靠近形成有效的转录激活子，激活报告基因 的转录。因此，可通过报告基因的表达与否， 的转录。因此，可通过报告基因的表达与否，筛选可与诱 结合的目的基因——Y。 饵X结合的目的基因 结合的目的基因 。
选择含有目的基因的组织或细胞，分离 选择含有目的基因的组织或细胞，分离mRNA
以上述mRNA为模板，逆转录合成第一链cDNA 为模板，逆转录合成第一链 以上述 为模板
合成第二链cDNA 合成第二链
将合成的cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，构 重组到质粒或噬菌体载体上， 将合成被检者DNA， 如果以野生型基因组DNA为被检者DNA，而以 DNA为被检者DNA 疾病突变型DNA为验动者(driver,也就是检测 疾病突变型DNA为验动者(driver,也就是检测 DNA为验动者(driver, 者)DNA，那么得到的是疾病个体基因组缺失的序 )DNA， 列。相反，以突变型DNA为被检者(tester)DNA， 相反，以突变型DNA为被检者(tester)DNA， DNA为被检者(tester)DNA 野生型DNA为检测DNA， 野生型DNA为检测DNA，可获得疾病基因组中重排 DNA为检测DNA 和扩增的序列。 和扩增的序列。
（2）差别显示反转录 ）差别显示反转录PCR（DDRT-PCR） （ ） 原理：每条成熟 的尾部均有polyA尾，除此 原理：每条成熟mRNA的尾部均有 的尾部均有 尾 以外，各基因 的序列各不相同； 以外，各基因mRNA的序列各不相同；据此，PCR 5’端 的序列各不相同 据此， 端 随机引物与模板cDNA的结合位置距 的结合位置距polyA尾的距离也随 随机引物与模板 的结合位置距 尾的距离也随 基因的不同而不同，用两端引物经 扩增后， 基因的不同而不同，用两端引物经RT-PCR扩增后，利用 扩增后 聚丙烯酰胺凝胶电泳将PCR产物据其分子不同分开，根 产物据其分子不同分开， 聚丙烯酰胺凝胶电泳将 产物据其分子不同分开 据一对组织细胞间电泳条带的不同， 据一对组织细胞间电泳条带的不同，选出差异表作。 ）无内含子、片段短、易操作。 2〕某特定基因在mRNA中的拷贝数＞在基因 〕某特定基因在 中的拷贝数＞ 中的拷贝数 组 中的拷贝数。 中的拷贝数。 3）由于成熟mRNA是转译成蛋白质的直接模 ）由于成熟 是转译成蛋白质的直接模 板， 可从cDNA序列中直接找到编码区，推测蛋 序列中直接找到编码区， 可从 序列中直接找到编码区 白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。 白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。
2、机械剪切（eg. 超声处理） 、机械剪切（ 超声处理） 优点： 优点：保持随机性 缺点：两端差不齐，不加修整难以克隆 缺点：两端差不齐， 3、部分酶切 、 即某一识别序列很短的RE不完全酶切 即某一识别序列很短的 不完全酶切DNA仅使 不完全酶切 仅使 其相应的酶切位点只有少部分被打断。 其相应的酶切位点只有少部分被打断。 识别4bp即每 即每256bp中就有一识别位点〕 中就有一识别位点〕 （eg. Sau 3A识别 识别 即每 中就有一识别位点 优点： 、 优点：a、保持随机性 b、两端有粘端，易克隆 、两端有粘端， c、群体较小易筛选 、
1、从目的细 、 胞中分离 mRNA
2、合成 、 cDNA第一链 第一链
3、合成 、 cDNA第二链 第二链
4、双链 、 cDNA转入载 转入载 体，转化大 肠杆菌， 肠杆菌，形 成PCR法 法RACE
目的基因的筛选
1、杂交筛选 、 （1）核酸探针筛选 ） 1）适用范围：对所需筛选的目的基因序列有 ）适用范围： 所了解，或已获得部分基因片段， 所了解，或已获得部分基因片段，想要克隆该基 因全长cDNA或基因组基因时使用。 或基因组基因时使用。 因全长 或基因组基因时使用
（三）目的基因的筛选
1、已知cDNA序列 、已知 序列——核酸分子杂交 序列 核酸分子杂交 2、已知表型差异 、 代表性差异分析
代表性差异分析(RDA, 代表性差异分析(RDA, reprehensive difference analysis)： analysis)： 代表性差异分析技术是在消减杂交技术的 基础上发展起来的，用于分离两个基因组之 基础上发展起来的，用于分离两个基因组之 间的差异序列。 间的差异序列。 原理： 原理：有血缘关系的患病个体与正常个体 基因组之间的差异可能就是疾病相关基因。 基因组之间的差异可能就是疾病相关基因。
Genomic library
cDNA library
Screening the library Comfirm and analysis of the 是指以mRNA为模板，在反转录酶的 为模板， 是指以 为模板 作用下，形成的互补 作用下，形成的互补DNA（complementary （ DNA， cDNA） ， ）
3、差异表达DNA片段的筛选 、差异表达 片段的筛选 适用范围： 适用范围：筛选不同组织之间或同一组织 在不同状况下表达有差异的未知基因。 在不同状况下表达有差异的未知基因。 （1）差示筛选 ） 原理：分别以两个需比较样品的 原理：分别以两个需比较样品的mRNA为 为 模板，合成各自的 放射性标记探针， 模板，合成各自的cDNA放射性标记探针隆。 号的差异，挑选表达差异的克隆。
2、抗体筛选 、 （1）适用范围：已有目的基因表达产物的特异 ）适用范围： 性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。 性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。 （2）原理：将cDNA定向克隆到表达载体屯构建 ）库中能表达目的基因的克隆结合，再 用标记的二抗与一抗结合， 用标记的二抗与一抗结合，指示目的基因所在克 隆。
（2）寡核苷酸探针筛选 ） 1）适用范围：对目的基因的表达产物的氨基酸 ）适用范围： 序列有所了解， 序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来 推导出核酸的可能序列， 推导出核酸的可能序列，合成寡核昔酸作为探针 2）原理同上节 ） 3）注意事项： ）注意事项： a ．探针足够长（＞ 个碱基） 探针足够长（＞ 个碱基） （＞18个碱基 A的获得（抽提染色体 基因组 的获得 抽提染色体DNA后） 后 1、完全酶切 、 即用某一RE处理 即用某一 处理DNA，将其所有的相应限制 处理 ， 性内切酶位点均打断。 性内切酶位点均打断。 优点：片段两端有粘端， 优点：片段两端有粘端，易克隆 缺点： 缺点： a、当一个基因中有两个以上酶切位 、 点时， 点时，将该基因克隆入两个以上载体中 且相互不重叠，难以筛选。 且相互不重叠，难以筛选。 b、一些过大或过小的片段不易克隆； 、一些过大或过小的片段不易克隆； c、群体太大、筛选工作量大。 、群体太大、筛选工作量大。
未 知 基 因 克 隆 策 略
Bait
Gene Pool
Example: How the normal cell transformed into tumor cell?
Tumor tissue
?
Normal tissue
Select the materials containing the targee cosmid YAC 9-22kb 30-45kb 100-1000kb
转染效率 105-106pfu/µgDNA µ 104-105pfu/µgDNA µ 500colon：是含全部序列的信息，所 克隆群体因其贮藏有基因组全部序列的信息， 的重组 克隆群体因其1）尽可能保证片段分割的随机性一（用识别顺序为 ）尽可能保证片段分割的随机性一（用识别顺序为4bp 部分酶切）； 的RE部分酶切）； 部分酶切 用部分酶解制备DNA片段而不 （2）极高的连接效率 ）极高的连接效率——用部分酶解制备 用部分酶解制备 片段而不 用机械剪切。 用机械剪切。
3、基因克隆的编码产物分析 、
1）在原核或真核细胞中利用全长cDNA表达的蛋白质， ）在原核或真核细胞中利用全长 表达的蛋白质， 表达的蛋白质 显示正确的生物学或酶学活性。 显示正确的生物学或酶学活性。 2）cDNA的核苷酸序列与从纯化蛋白质得到的肽段的氨 ） 的核苷酸序列与从纯化蛋白质得到的肽段的氨 基酸序列相吻合。 基酸序列相吻合。 3）用cDNA克隆的转录物在体外合成的多肽，其肽图与 ） 克隆的转录物在体外合成的多肽， 克隆的转录物在体外合成的多肽 真蛋白的肽图相吻合。 真蛋白的肽图相吻合。 4）用cDNA克隆的转录物在体内或体外合成的多肽与抗 ） 克隆的转录物在体内或体外合成的多肽与抗 目的蛋白的抗体发生免疫沉淀。 目的蛋白的抗体发生免疫沉淀。 5）真蛋白与抗合成肽抗体发生免疫沉淀，而该合成肽的 ）真蛋白与抗合成肽抗体发生免疫沉淀， 序列由克隆化cDNA的核苷酸序列确定。 的核苷酸序列确定。 序列由克隆化 的核苷酸序列确定