未知基因克隆策略及进展

基因组文库
1．基因组文库：是含有某种生物体全部基因的随机片段 ．基因组文库： 的重组DNA克隆群体因其贮藏有基因组全部序列的信息，所 克隆群体因其贮藏有基因组全部序列的信息， 的重组 克隆群体因其贮藏有基因组全部序列的信息 以称为基因组文库。 以称为基因组文库。 2．要求 ． （1）尽可能保证片段分割的随机性一（用识别顺序为 ）尽可能保证片段分割的随机性一（用识别顺序为4bp 部分酶切）； 的RE部分酶切）； 部分酶切 用部分酶解制备DNA片段而不 （2）极高的连接效率 ）极高的连接效率——用部分酶解制备 用部分酶解制备 片段而不 用机械剪切。 用机械剪切。
（2）差别显示反转录 ）差别显示反转录PCR（DDRT-PCR） （ ） 原理：每条成熟 的尾部均有polyA尾，除此 原理：每条成熟mRNA的尾部均有 的尾部均有 尾 以外，各基因 的序列各不相同； 以外，各基因mRNA的序列各不相同；据此，PCR 5’端 的序列各不相同 据此， 端 随机引物与模板cDNA的结合位置距 的结合位置距polyA尾的距离也随 随机引物与模板 的结合位置距 尾的距离也随 基因的不同而不同，用两端引物经 扩增后， 基因的不同而不同，用两端引物经RT-PCR扩增后，利用 扩增后 聚丙烯酰胺凝胶电泳将PCR产物据其分子不同分开，根 产物据其分子不同分开， 聚丙烯酰胺凝胶电泳将 产物据其分子不同分开 据一对组织细胞间电泳条带的不同， 据一对组织细胞间电泳条带的不同，选出差异表达基因 的片段。该片段可作为探针，筛选 文库。 的片段。该片段可作为探针，筛选cDNA文库。 文库
优点 1）无内含子、片段短、易操作。 ）无内含子、片段短、易操作。 2〕某特定基因在mRNA中的拷贝数＞在基因 〕某特定基因在 中的拷贝数＞ 中的拷贝数 组 中的拷贝数。 中的拷贝数。 3）由于成熟mRNA是转译成蛋白质的直接模 ）由于成熟 是转译成蛋白质的直接模 板， 可从cDNA序列中直接找到编码区，推测蛋 序列中直接找到编码区， 可从 序列中直接找到编码区 白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。 白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。
2、抗体筛选 、 （1）适用范围：已有目的基因表达产物的特异 ）适用范围： 性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。 性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。 （2）原理：将cDNA定向克隆到表达载体屯构建 ）原理： 定向克隆到表达载体屯构建 成表达文库， 成表达文库，用能与目的基因表达产物特异结合 的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合， 的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合，再 用标记的二抗与一抗结合， 用标记的二抗与一抗结合，指示目的基因所在克 隆。
（2）寡核苷酸探针筛选 ） 1）适用范围：对目的基因的表达产物的氨基酸 ）适用范围： 序列有所了解， 序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来 推导出核酸的可能序列， 推导出核酸的可能序列，合成寡核昔酸作为探针 2）原理同上节 ） 3）注意事项： ）注意事项： a ．探针足够长（＞ 个碱基） 探针足够长（＞ 个碱基） （＞18个碱基 b．注意密码子的简并性 ．
未 知 基 因 克 隆 策 略
Bait
Gene Pool
Example: How the normal cell transformed into tumor cell?
Tumor tissue
?
Normal tissue
Select the materials containing the target Gene
一般的三种常用基因组文库载体的装载量
装载量 λ phage cosmid YAC 9-22kb 30-45kb 100-1000kb
转染效率 105-106pfu/µgDNA µ 104-105pfu/µgDNA µ 500colonies/µgDNA µ
构建基因组文库的大体步骤
（1）以噬菌体为载体构建文库 ） （2）以cosmid为载体构建文库 ） 为载体构建文库
3、功能结合法筛选 、 适用范围： 适用范围：已知目的基因表达产物的功能 （1）噬菌体显示法（phage display） ）噬菌体显示法（ ） （2）酵母双杂交法 ） （3）酵母单杂交法 ）
（1）噬菌体显示法 ）
（2）酵母双杂交法 ）
GAL4-AD
BD UAS
GAL1-lacZ
X
BD UAS GAL1-lacZ
如果以野生型基因组DNA为被检者DNA， 如果以野生型基因组DNA为被检者DNA，而以 DNA为被检者DNA 疾病突变型DNA为验动者(driver,也就是检测 疾病突变型DNA为验动者(driver,也就是检测 DNA为验动者(driver, 者)DNA，那么得到的是疾病个体基因组缺失的序 )DNA， 列。相反，以突变型DNA为被检者(tester)DNA， 相反，以突变型DNA为被检者(tester)DNA， DNA为被检者(tester)DNA 野生型DNA为检测DNA， 野生型DNA为检测DNA，可获得疾病基因组中重排 DNA为检测DNA 和扩增的序列。 和扩增的序列。
基因组文库的构建
的获得（ （一）基因组DNA的获得（抽提染色体 基因组 的获得 抽提染色体DNA后） 后 1、完全酶切 、 即用某一RE处理 即用某一 处理DNA，将其所有的相应限制 处理 ， 性内切酶位点均打断。 性内切酶位点均打断。 优点：片段两端有粘端， 优点：片段两端有粘端，易克隆 缺点： 缺点： a、当一个基因中有两个以上酶切位 、 点时， 点时，将该基因克隆入两个以上载体中 且相互不重叠，难以筛选。 且相互不重叠，难以筛选。 b、一些过大或过小的片段不易克隆； 、一些过大或过小的片段不易克隆； c、群体太大、筛选工作量大。 、群体太大、筛选工作量大。
已知蛋白质的 表达差异
纯化的蛋白质 氨基酸序列测定
已知蛋白ห้องสมุดไป่ตู้功能
比较并寻找差异 比较并寻找差异 表达的 片段 表达的DNA片段
制备抗体
设计寡核苷酸探针
功能结合法
筛选cDNA文库 文库 筛选
cDNA序列 序列
（四）目的基因的确定及分析
1、DNA的顺序测定 、 了解克隆的DNA片段的 的顺序测定——了解克隆的 了解克隆的 片段的 核苷酸一级结构。 核苷酸一级结构。 2、基因顺序分析 、 （1）寻找基因的开放读框 ） （ 2）以核苷酸顺序推测相应蛋白质的氨基酸顺序 ） （ 3）根据氨基酸顺序，推测蛋白质的种类、性质、 ）根据氨基酸顺序，推测蛋白质的种类、性质、 结构、功能。 结构、功能。
（三）目的基因的筛选
1、已知cDNA序列 、已知 序列——核酸分子杂交 序列 核酸分子杂交 2、已知表型差异 、 代表性差异分析
代表性差异分析(RDA, 代表性差异分析(RDA, reprehensive difference analysis)： analysis)： 代表性差异分析技术是在消减杂交技术的 基础上发展起来的，用于分离两个基因组之 基础上发展起来的，用于分离两个基因组之 间的差异序列。 间的差异序列。 原理： 原理：有血缘关系的患病个体与正常个体 基因组之间的差异可能就是疾病相关基因。 基因组之间的差异可能就是疾病相关基因。
1、从目的细 、 胞中分离 mRNA
2、合成 、 cDNA第一链 第一链
3、合成 、 cDNA第二链 第二链
4、双链 、 cDNA转入载 转入载 体，转化大 肠杆菌， 肠杆菌，形 成文库
PCR法 法
RACE
目的基因的筛选
1、杂交筛选 、 （1）核酸探针筛选 ） 1）适用范围：对所需筛选的目的基因序列有 ）适用范围： 所了解，或已获得部分基因片段， 所了解，或已获得部分基因片段，想要克隆该基 因全长cDNA或基因组基因时使用。 或基因组基因时使用。 因全长 或基因组基因时使用
2、机械剪切（eg. 超声处理） 、机械剪切（ 超声处理） 优点： 优点：保持随机性 缺点：两端差不齐，不加修整难以克隆 缺点：两端差不齐， 3、部分酶切 、 即某一识别序列很短的RE不完全酶切 即某一识别序列很短的 不完全酶切DNA仅使 不完全酶切 仅使 其相应的酶切位点只有少部分被打断。 其相应的酶切位点只有少部分被打断。 识别4bp即每 即每256bp中就有一识别位点〕 中就有一识别位点〕 （eg. Sau 3A识别 识别 即每 中就有一识别位点 优点： 、 优点：a、保持随机性 b、两端有粘端，易克隆 、两端有粘端， c、群体较小易筛选 、
Genomic library
cDNA library
Screening the library Comfirm and analysis of the target gene
cDNA文库的构建 文库的构建
cDNA是指以 是指以mRNA为模板，在反转录酶的 为模板， 是指以 为模板 作用下，形成的互补 作用下，形成的互补DNA（complementary （ DNA， cDNA） ， ）
选择含有目的基因的组织或细胞，分离 选择含有目的基因的组织或细胞，分离mRNA
以上述mRNA为模板，逆转录合成第一链cDNA 为模板，逆转录合成第一链 以上述 为模板
合成第二链cDNA 合成第二链
将合成的cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，构 重组到质粒或噬菌体载体上， 将合成的 重组到质粒或噬菌体载体上 建cDNA文库 文库
3、差异表达DNA片段的筛选 、差异表达 片段的筛选 适用范围： 适用范围：筛选不同组织之间或同一组织 在不同状况下表达有差异的未知基因。 在不同状况下表达有差异的未知基因。 （1）差示筛选 ） 原理：分别以两个需比较样品的 原理：分别以两个需比较样品的mRNA为 为 模板，合成各自的 放射性标记探针， 模板，合成各自的cDNA放射性标记探针，与其 放射性标记探针 中之一的cDNA文库进行原位杂交，根据杂交信 中之一的 文库进行原位杂交， 文库进行原位杂交 号的差异，挑选表达差异的克隆。 号的差异，挑选表达差异的克隆。
3、基因克隆的编码产物分析 、
1）在原核或真核细胞中利用全长cDNA表达的蛋白质， ）在原核或真核细胞中利用全长 表达的蛋白质， 表达的蛋白质 显示正确的生物学或酶学活性。 显示正确的生物学或酶学活性。 2）cDNA的核苷酸序列与从纯化蛋白质得到的肽段的氨 ） 的核苷酸序列与从纯化蛋白质得到的肽段的氨 基酸序列相吻合。 基酸序列相吻合。 3）用cDNA克隆的转录物在体外合成的多肽，其肽图与 ） 克隆的转录物在体外合成的多肽， 克隆的转录物在体外合成的多肽 真蛋白的肽图相吻合。 真蛋白的肽图相吻合。 4）用cDNA克隆的转录物在体内或体外合成的多肽与抗 ） 克隆的转录物在体内或体外合成的多肽与抗 目的蛋白的抗体发生免疫沉淀。 目的蛋白的抗体发生免疫沉淀。 5）真蛋白与抗合成肽抗体发生免疫沉淀，而该合成肽的 ）真蛋白与抗合成肽抗体发生免疫沉淀， 序列由克隆化cDNA的核苷酸序列确定。 的核苷酸序列确定。 序列由克隆化 的核苷酸序列确定
GAL4-AD
X
BD UAS
Y
GAL1-lacZ
基本原理： 基本原理：
将编码某一蛋白X（诱饵 序列与DNA结 将编码某一蛋白 （诱饵bait）的DNA序列与 ） 序列与 结 合域（ 合域（binding domain，BD）的编码序列连接使其表达融 ， ） 合蛋白（ ）；将待检基因 合蛋白（BD-X）；将待检基因（Y）的cDNA与DNA激活 ）；将待检基因（ ） 与 激活 域（acting domain，AD）的编码序列连接，使其表达融 ， ）的编码序列连接， 合蛋白（AD-Y）；将两个融合基因所在载体共同转化酵 ）；将两个融合基因所在载体共同转化酵 合蛋白（ ）； 母细胞（含报告基因和上游激活序列 ）；若 与 不 母细胞（含报告基因和上游激活序列UAS）；若X与Y不 ）； 能相互作用，则不表达报告基因； 能相互作用， 能相互作用，则不表达报告基因；若X与Y能相互作用， 与 能相互作用 则使BD和 靠近形成有效的转录激活子 靠近形成有效的转录激活子， 则使 和AD靠近形成有效的转录激活子，激活报告基因 的转录。因此，可通过报告基因的表达与否， 的转录。因此，可通过报告基因的表达与否，筛选可与诱 结合的目的基因——Y。 饵X结合的目的基因 结合的目的基因 。