基因敲除2
基因敲除技术的原理和应用
基因敲除技术是一种基因编辑技术，通过这种技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究基因的功能和作用机制。
基因敲除技术的原理：
1. 基因敲除可以通过同源重组的方法实现。
具体来说，研究人员将一个含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过同源序列的识别和同源重组将待编辑的基因删除。
2. 另一种基因敲除方法是随机突变。
研究人员将含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过随机突变的方法产生突变体。
基因敲除技术的应用：
1. 研究基因的功能和作用机制。
通过基因敲除技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究该基因的作用和影响。
2. 疾病治疗。
基因敲除技术也可以用于治疗某些疾病，如遗传性疾病、癌症等。
3. 药物开发。
研究人员可以通过基因敲除技术来研究药物的作用机制和效果，以开发新的药物。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
基因敲除
4.制作感受态细胞 参照链霉菌中想要敲除的基因A相应的核 苷酸序列，设计引物1、2，其中引物1中有 EcoR I 的酶切位点，引物2中有BamH I 酶 切位点，以链霉菌的基因组DNA 为模板， 引物1 和引物2 进行PCR 扩增。将PCR 获 得的A基因片段经纯化及EcoR I 和BamH I 双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌－ 链 霉菌穿梭质粒载体pGH112 连接，得到重组 质粒pGH112-A 。将验证正确的重组质粒 pGH112 – A 电转至Ecoli BW25113 /pIJ790 感受态中，获得E． coliBW25113 /pIJ790 /pGH112-A 转化子，将其制作成 感受态细胞。
Thanks
Flowchart of gene disruption by PCR-targeting
1.质粒 质粒pIJ773中安普抗性基因的序列 ( 该序列中还包含转移复制起始点oriT 以及FLP 重组酶的识别位点FRT 序列， oriT 便于后面重组质粒的接合转移) 。
2.引物设计 设计一对长59nt及58nt 的引物( 引 物3 和引物4) ，其中引物3 包含20nt 的安普抗性基因上游的FRT 序列以及A基 因（想要敲除的基因）上游的一段39nt 的互补序列，引物4 包含19nt 的安普抗 性基因下游的FRT 序列以及A基因下游的 一段39nt 的互补序列。 3.PCR产生阻断片段 按此引物PCR 所得产物中应包含一个 安普抗性基因，并且在它的两端含有各 带有39bp 的A基因上下游的同源序列， 将此PCR 产物称为安普抗性框。以含有 安普抗性基因的质粒pIJ773 作为模板， 引物3 和引物4 进行PCR 扩增，产生阻 断片段。
Gene disruption by PCR-targeting
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因敲除
基因敲除基因敲除和基因嵌入技术该技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。
目前用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P 系统、FLPI系统等。
[编辑本段]基因敲除(knock-out)基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。
所谓胚胎干细胞(EmbryonicStem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cellmass，ICM)细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。
在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。
而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。
尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。
现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
分子生物学中的基因敲除技术
分子生物学中的基因敲除技术基因是生物体内控制遗传信息传递和表达的基本单位。
基因拥有编码DNA序列，其不同的组合与排列方式决定了生物体的生理和形态特征。
基因突变会导致基因功能的改变，从而引起各种疾病。
因此，人们对于基因的研究一直是分子生物学领域的重点之一。
近年来，基因敲除技术的发展为基因功能的研究带来了革命性的变化。
本文将对分子生物学中的基因敲除技术进行介绍。
一、基因敲除技术的概述基因敲除技术又称基因敲除或基因敲除法，是指通过人工干预的方法，使其中一个或多个基因失去功能的一种技术手段。
它的主要思路是选取某些与目标基因相关的DNA片段进行改造，然后将这些片段通过基因修饰技术导入细胞中，从而抑制目标基因的表达，并从中研究基因功能。
在基因敲除技术的发展史上，一共经历了三个阶段。
第一阶段是限制酶切割技术阶段，该技术主要利用酶切割技术，即利用特定限制酶切割目标基因的特定区域，破坏基因的完整性以达到抑制基因表达的目的。
第二阶段是RNAi技术阶段，该技术利用速度和精度等优势，有效地抑制目标基因的表达。
最新阶段是CRISPR/Cas9基因编辑技术阶段，该技术可以直接在基因组中精确定位和切割目标，其准确性高、效果显著。
二、限制酶切法限制酶切法是利用限制酶断裂DNA，粘性末端互相结合形成重组、重组与质粒互相连接，经过再次引入宿主细胞，利用靶向位点引起相应基因抑制或丧失功能的方法。
具体方法如下：首先选择一个用于酶切靶基因的限制酶；然后，设计基于该酶作用的引物，并用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因的片段；接下来，利用限制酶切割PCR产物，得到一段粘性端的DNA片段，然后再将其引入宿主细胞中并与目标基因的序列进行重组。
通过该方法，就可以抑制或消除目标基因的表达，对基因功能进行研究。
不过，限制酶切法也具有一些局限性。
例如，它不能实现基因的全局敲除，因为在粘性端重组的过程中，有一定概率发生错误的重组，造成基因复制，而复制后的多个基因片段均可导致基因的表达。
LEU2基因敲除对工业啤酒酵母高级醇生成量的影响_佐一含
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基因敲除
1(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。
CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
刚刚发表在《科学》（Science）（2013年,1,3）的两篇文章，证明Cas9系统 能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组 （HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。
文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。
这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。
虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。
在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统唯尚立德已经利用CRISPR/Cas9在斑马鱼，哺乳动物细胞上成功实现基因敲除和基因敲入，现推出如下技术服务：1. 应用CRISPR /Cas9提供稳定细胞系靶向基因敲除、敲入技术服务；2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务，包括小鼠，大鼠，斑马鱼等；近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。
研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。
基因敲除技术
２０１７年第４期87农业科技自１９８７年Ｃａｐｅｃｃｈｉ等采用小鼠胚胎干细胞成功介导定向基因转移（也叫做基因打靶），使小鼠体内的特定基因丧失功能以来，基因敲除已成为一种精确地人工修饰基因组的途径，并首先在模式生物小鼠中建立。
基因敲除技术不仅可以研究基因功能、创造有特定经济价值的动物，而且可以指导对人类基因的研究，在阐明人类疾病地说发生机理、开发更为有效的治疗手段及药物中具有重要价值。
1、基因敲除技术的基本原理基因打靶是在同源重组和ＥＳ细胞成功分离的基础之上实现的［１－２］。
基因敲除技术应用ＤＮＡ同源重组原理，利用一段人工修饰的同源片段代替靶基因片段，使外源基因引入基因组ＤＮＡ的特定片段上，随基因组ＤＮＡ的复制而稳定复制，从而达到基因敲除的目的。
在基因敲除中，实现基因定点整合的唯一途径就是利用遗传物质的同源重组机制。
2、基因敲除技术的必要条件２．１、打靶载体的构建。
一般来说，打靶载体包含与基因座上相应的ＤＮＡ序列完全同源的２～１０ｋｂ序列、经过修改后的目标基因序列和标记基因，为方便从转化细胞中挑选发生同源整合的细胞。
常用的打靶载体有两类—插入型和置换型。
插入型载体通常是由某些逆转录病毒介导的［３］，其断裂位点通常位于同源序列内，选择基因与同源目的序列紧紧相连，载体ＤＮＡ上的同源序列与染色体靶位点发生一次同源重组，从而将整个载体整合到染色体靶位点上［４］。
而置换型载体转化受体细胞，载体含有两段与基因组靶序列同源的ＤＮＡ片段，中间插入正筛选标记，一般使用的是细菌氨基糖苷磷酸转移酶基因（ｎｅｏ），可以用Ｇ４１８筛选稳定整合载体ＤＮＡ的细胞。
负筛选标记是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ），用ＧＡＮＣ筛选除去随机整合了载体ＤＮＡ的细胞。
以上两种载体的区别在于，载体与靶基因组同源序列双链断裂位点的不同。
２．２、细胞培养和转化。
基因靶向整合在动物细胞中非常困难，以小鼠胚胎干细胞为受体细胞的有关研究显示，外源ＤＮＡ的平均转化率是５％～１０％，其中发生染色体整合的细胞仅有１％～１０％，而在这些整合外源ＤＮＡ的细胞中，同源重组的比例是１０－３，由于动物原代细胞的存活期有限，所以有效的细胞培养技术和ＤＮＡ导入技术是基因敲除实验的关键。
基因敲除技术与转基因技术的比较研究
基因敲除技术与转基因技术的比较研究生物技术的发展和应用为人类带来了巨大的利益。
然而，与此同时，也不可避免地带来了一些争议。
在生物技术领域，基因敲除技术和转基因技术是两个热门话题，它们的利用在不同领域具有巨大的应用前景。
本文旨在比较基因敲除技术与转基因技术，帮助读者更好地了解它们的区别和优劣之处。
一、基因敲除技术基因敲除技术是一种通过DNA重组实现基因灭活或剔除的方法。
它通常通过利用重组酶切，将合成的DNA序列植入到细胞中，可以导致目标基因在细胞内被敲除或被靶向沉默。
基因敲除技术的优势在于可以准确地控制目标基因，从而促进基因治疗的发展。
此外，它还可以为疾病基因的研究提供新的平台。
基因敲除技术在基础研究、药物研发、细胞修饰和癌症研究等领域有着广泛的应用。
例如，通过敲除恶性肿瘤细胞中的抑癌基因，可以阻止恶性肿瘤的发展；在研发新的药物时，可以通过基因敲除来验证药物的靶点，从而确定药物的作用机理；以及通过基因敲除来研究不同基因在特定生物过程中的作用，例如神经发育和心肌细胞的分化。
二、转基因技术与基因敲除技术不同，转基因技术针对的是在植物和动物等有机体中插入外来基因的技术。
转基因技术常用的几种方法包括随机插入、受控插入、基因扩增和胚胎基因修饰。
转基因技术可以实现“设计”生物体，也就是人为地改变其生物特性。
转基因技术在食品生产、医疗和工业生产等领域有着广泛的应用。
例如，经过转基因技术改造后的植物可以抵抗病虫害，提高产量和质量，从而为食品生产提供了可能；在医疗领域，转基因技术可以用于生产抗体和蛋白质药物，或者用于治疗癌症、糖尿病和多发性硬化等疾病。
此外，转基因技术还可以用于工业制造，例如用转基因植物生产生物燃料、革命纤维和生物塑料等。
三、基因敲除技术与转基因技术的比较基因敲除技术和转基因技术虽然都是生物技术领域的重要发展方向，但二者还是有所不同的。
基因敲除技术致力于通过切断DNA序列来消除不必要的基因，而转基因技术则是通过插入新的基因来增强或改变生物体的功能。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
基因敲除的原理
《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。
那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。
一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
同源重组的基因敲除
RECOMBINATION
第一次重组
A、B为一段DNA序列，并非是基因
A
A1 A2
目的基因
B
a1
a2
a
构建质粒 b
A1
a2
b
a1
A2
目的基因
B
第二次重组的第一种情况 A1 a2
b
a1
A2
目的基因
B
b A1 a2 b1 b2 a1 A2
目的基因
B2
B1
B
A1 a2 b1 B2 目的基因 a1 A2
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因
phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from
基因敲除技术研究进展及其应用
目录
01 一、基因敲除技术的 基本原理和历史发展
02
二、基因敲除技术的 最新研究进展
03
三、基因敲除技术的 应用实例
04 四、未来展望
05 参考内容
基因敲除技术是一种重要的分子生物学研究工具，它通过删除或灭活特定基 因，研究基因功能以及其对细胞生命活动的影响。近年来，随着基因敲除技术的 不断发展和优化，其在医学、生物学等领域的应用也越来越广泛。本次演示将介 绍基因敲除技术
在工业领域，基因敲除技术主要应用于微生物工程、生物制药等领域。利用 基因敲除技术，科学家们可以改造微生物和菌种，提高微生物的工业发酵效率和 产率，为生物制药和化工生产等领域提供有效手段。
近年来，基因敲除技术的研究进展迅速，新的技术和应用不断涌现。例如， 通过结合基因编辑技术，科学家们可以实现对特定基因的精细调控，从而达到更 高的目标基因敲除效率；此外，利用基因敲除技术，科学家们还成功培育出多种 新型生物材料和工业菌种，为相关领域的发展带来了新的突破。
四、未来展望
随着基因敲除技术的不断发展和优化，未来其在医学、农业、生物学等领域 的应用前景将更加广阔。但同时也面临着一些挑战和问题。首先，如何提高基因 敲除技术的准确性和效率仍然是需要解决的重大问题。其次，如何将基因敲除技 术应用到更多的
生物物种和细胞类型中也是一个具有挑战性的问题。此外，如何在确保有效 性的同时降低基因敲除技术的成本和风险也是一个需要和研究的问题。
1、优点
基因敲除技术具有许多优点。首先，它是一种精确的基因编辑手段，可以准 确地在特定位置敲除或替换基因。其次，基因敲除技术可以用于研究基因的功能 及其对细胞生命活动的影响，有助于深入了解生命的本质和规律。此外，基因敲 除技术还可以用
植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除是一个复杂的过程，涉及精确地去除或改变特定基因的序列，从而阻断该基因的表达。
这一技术在植物研究和农业生物技术中非常重要，用于研究基因功能、改善作物性状等。
以下是基本的植物基因敲除技术步骤：1.目标基因的选择和设计：●首先，研究人员需要确定要敲除的目标基因。
●设计特定于该基因的导向序列，通常利用RNA指导的核酸酶（如CRISPR-Cas9系统）实现特定位点的切割。
2.构建敲除载体：●制备包含所需敲除序列的载体，这可能包括导向RNA（gRNA）和Cas9或其他核酸酶的编码序列。
●将这些构建克隆到合适的载体中，用于植物转化。
3.植物细胞的转化：●使用农杆菌介导转化、基因枪或其他方法将构建的载体转移到植物细胞中。
●在细胞内，导向RNA将核酸酶引导至目标基因的特定位置，导致DNA双链断裂。
4.筛选和培养转化植物：●筛选含有敲除构建的植物细胞。
●使用组织培养技术促进这些细胞的生长和分化，形成完整的植物。
5.分析和验证基因敲除：●对转化植物进行分子水平的分析，确认目标基因已被敲除或改变。
●这通常涉及PCR、序列测定和/或基因表达分析。
6.表型分析：●观察和记录敲除目标基因后植物的表型变化。
●这有助于理解该基因在植物发育或代谢中的作用。
7.进一步的研究和应用：●基于敲除结果，进行进一步的功能验证实验。
●在农业或生物技术中应用敲除技术，例如开发抗病或高产的作物品种。
植物基因敲除是一个高度技术化的过程，需要精确的设计和细致的实验操作。
随着基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的发展，这一过程变得更加高效和精确。
基因敲除流程
基因敲除流程基因敲除是一种常用的遗传工程技术，它通过改变生物体内特定基因的DNA序列，从而使得该基因失去功能。
基因敲除技术在生物学研究和生物医学领域具有重要的应用价值，可以帮助科学家们研究基因在生物体内的功能和作用机制，也为疾病治疗和基因治疗提供了新的思路和方法。
基因敲除流程主要包括以下几个步骤：1. 选择目标基因，首先，需要确定要敲除的目标基因。
在选择目标基因时，需要充分考虑该基因在生物体内的功能和作用，以及敲除后可能带来的生理和生化效应。
2. 构建敲除载体，接下来，需要构建含有目标基因敲除所需的DNA片段的敲除载体。
敲除载体通常包括选择标记基因和敲除目标基因的DNA片段，通过重组技术将其连接在一起，并导入到宿主细胞内。
3. 寻找敲除细胞系，将构建好的敲除载体导入到细胞内后，需要筛选出含有目标基因敲除的细胞系。
这一步通常需要利用选择标记基因对细胞进行筛选，以获得含有目标基因敲除的细胞系。
4. 验证敲除效果，一旦获得含有目标基因敲除的细胞系，就需要对敲除效果进行验证。
通常可以利用PCR、Western blot等技术对细胞内的DNA和蛋白进行检测，以确认目标基因已经被成功敲除。
5. 稳定传代，最后，需要将含有目标基因敲除的细胞系进行稳定传代，以确保目标基因的敲除效果可以在细胞的后代中得到稳定传递。
总的来说，基因敲除流程包括目标基因选择、敲除载体构建、敲除细胞系筛选、敲除效果验证和稳定传代等几个关键步骤。
通过这些步骤，科学家们可以成功地实现对目标基因的敲除，为进一步的基因功能研究和生物医学应用奠定了基础。
基因敲除技术的不断发展和完善，为生物学和医学领域的研究提供了强大的工具和支持。
相信随着技术的进步和应用的拓展，基因敲除技术将在未来发挥更加重要的作用，为人类健康和生命科学的发展带来更多的希望和可能。
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PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 Байду номын сангаас生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。 表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进 而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变， 达到研究目的基因的目的。 得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中 一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因 敲除模型，需要进行至少两代遗传。
• 纯合体又称同型合子或同质合子。由两个基因型相同的配 子所结合而成的合子，亦指由此种合子发育而成的生物个 体。纯合体的同源染色体，在其对应的一对或几对基因座 位上，存在着完全相同的等位基因，如AA、aa、AABB、 AAbb、aaBB、AABBcc、aaBBcc等等，具有这些基因型的 生物，就这些成对的基因来说，都是纯合体。在它们的自 交后代中，这几对基因所控制的性状，不会发生分离。
载体构建
1. 2. 3. 获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此ＤＮＡ 片段克隆到一般的质粒载体中； 从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列， 只留部分序列在线性质粒载体的两端； 将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中， 使之位于残留目的基因同源顺序的中间；
4.
在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将Ｈ
基因敲除的影响因素
基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的 细胞数与转染的细胞总数之比，又称同源重组效率。基因 打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大，其波动性来 自较多的影响因素。
(1) 打靶载体的影响
同源片段的来源影响，尽量选择与靶细胞相同品系的基因 片段作为同源片段，可减少碱基错配。当载体同源序列长 度从4kb增加至9kb时，基因打靶效率增加10倍。研究发现， 同源序列达一定长度后，继续的增加对同源重组效率不产 生显著影响。
基因打靶技术的发展简史
• Joshua Lederberg由于在细菌中首先证实同源基因间重组的 原理而获得了1958年的诺贝尔奖。 • Capecchi和Smithies都首先预见到新的遗传物质可以通过同 源重组引入哺乳动物细胞的基因组，并对基因进行特异性 修饰和改造。 • 1980年，Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核 可以显著提高基因转移的效率。
同源染色体交叉互换
• 同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或 者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姊 妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。同源重组在进化 过程中高度保守。
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：胚胎干细胞是早期 胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞。 具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。 • 嵌合体：遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的 个体。免疫学上则指一个机体身上有两种或两种以上染色 体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排 斥反应，相互间处在嵌合状态。同一器官出现不同性状的 生物体。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
同源重组基因敲除
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomycin)的抗药基因。细胞表达 该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
完全基因敲除
完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在 细胞或者动物个体中的活性完全消除。 技术路线 基因载体的构建 ES 细胞的获得 同源重组 选择筛选已击中的细胞 表型研究 得到纯合体
打靶载体：基因载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序 列是影响同源重组效率的关键因素。通常都包含有两段 与打靶目标位点两端同源的区域，中间一段不同源且为 目的序列，并带有某种药物筛选标记。
2．置换型载体(gene-replacement vector)：断裂位点位于 同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列 内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶 位序列，载体DNA 同源目的序列与染色体靶位点进行两 次同源重组。目前，大多数基因敲除实验都采用置换型载 体进行。
基因打靶的主要筛选策略
基因敲除
韩学凤
概念
• 基因敲除(gene knock-out)又称基因打靶，该技术通过外 源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修 饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段 共同稳定遗传等特点。它是在胚胎干细胞技术和同源重组 技术基础上发展起来的。 • 目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。
• 1981年，Evans等和Marin分别报道从正常的小鼠囊胚中分 离了ES细胞。 • Evans等研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的 ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系。 • 1987年，Evans等和Monk等的研究小组在小鼠胚胎干细胞 中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因(Hprt)的进行改造，并 获得了经生殖系遗传的突变小鼠。 • 1989年，真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生。
名词解释
• 同源染色体是指:一条来自父方，一条来自母方，形状，大小， 结构基本相同，且在减数第一次分裂时能两两配对(联会)的染 色体。 • 联会后的两条同源染色体,是经过染色体复制后的。即每条染 色体含有二条姐妹染色单体。二条染色体就含有四条染色单 体， 故叫四分体。 在配对(联会)的一对同源染色体中,由一个 着丝点相连的二条染色单体叫姐妹染色体单体。由不同着丝 点相连的染色单体，就叫非姐妹染色单体。 因此应该说在减 数第一次分裂时,联会(配对)的同源染色体中。既有姐妹染色 单体,也有非姐妹染色单体。
原理：利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源
片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上 同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使 外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因 插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。
分类：
完全性基因敲除 条件性基因敲除 诱导性基因敲除
新霉素抗性基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的 插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因 产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。 ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞， 最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具 有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除 的理想实验动物。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• Capecchi随后证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动 物细胞染色体的同源序列间。证明这种有缺陷的抗性基因 可以通过与外源DNA间的同源重组得到修复。
• 1985，Smithies实现了人工打靶载体和细胞染色体上β-球蛋 白基因间的同源重组。
• Whitten于1956年成功地使单细胞的受精卵在体外发育到囊 胚阶段。 • Brinster于1965年建立了微滴培养技术,用于着床前小鼠胚胎 的培养。 • Mclaren等对输卵管移植和子宫移植条件进行了优化,并最 终使得通过胚胎移植从体外培养的胚胎产生活的小鼠成为 一种常规的技术。 • Gardner（嘉德纳）建立了将分离的细胞注射入宿主囊胚获 得嵌合体小鼠的方法。