糖胺聚糖的分析测定方法
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糖胺聚糖中心蛋白的分析[15 ] :糖胺聚糖经过糖胺聚糖 类酶降解后经 SDS - PA GE 后能够很好地分离 ,利用特异性 的抗体可识别中心蛋白的种类和联接顺序 。 2. 2 单糖组分测定 2. 2. 1 己糖组分测定
以前定性单糖都是应用经典的化学 、物理方法 ,现在已 经建立了多种快速简便定性 、定量分析单糖的方法 。
纸层析 ( PC) 、薄层层析 ( TLC) 都是以已知结构的单糖 作为标准物 ,根据保留时间等特征数值来判断单糖的种类 。 气相 ( GC) 分析时先将单糖衍生化处理成易挥发的组分 ,常 采用的衍生化方法有硅烷基化和乙酰化 。高效液相色谱法 ( HPLC) 则克服了 GC 需衍生化的缺陷 ,它可直接进样测定 。 同样离子色谱法不需要衍生化处理 ,而且检测灵敏度甚至 比 HPLC 更高 。质谱 ( MS) 和核磁共振 (NMR) 常用于单糖 和多糖精细结构的研究 ,气相 —质谱已应用于甲基化产物 的鉴别 。
己糖构型测定[16 ] :糖类物质中手性原子较多 ,其旋光性 与其空间构型也有关 ,一般我们可以由旋光度值直接判断 单糖为α型还是β型 ,通常β型单糖旋光度值较α型负很 多 。比较α糖酶和β糖酶对多糖降解效果 ,也可得出糖胺聚 糖中某一单糖主要以何种构型存在[2 ,17 ] 。糖胺聚糖红外光 谱图中 ,890cm - 1 吸收蜂来判别α糖苷键的存在 ,840cm - 1
48
水产科学
第 24 卷
比浊法应用于糖类和酯类水解产物中无机硫酸根的测定之 后 ,现在该法已被普遍应用于糖胺聚糖硫酸根的定量分析 。 3. 1. 3 主链及侧链联接方式
高碘酸氧化 : 高碘酸可以选择性地氧化断裂糖分子中 的连二羟基或连三羟基 ,生成相应的多糖醛 、甲酸 ,反应定 量地进行 。每开裂一个 C —C 键消耗一分子高碘酸 ,通过测 定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量 ,可以判断糖苷键的位 置 、连接方式 、支链状况和聚合度等结构信息 。高碘酸氧化 反应必须在控制的条件下进行 ,以避免副反应的产生 (超氧 化反应) 。一般使多糖与最小量的高碘酸反应 ,溶液 p H 值 控制在 3～5 ,且应避光 、低温 。
中图分类号 : Q538
文献标识码 : C
糖胺聚糖 ( Glycosaminoglycan , GA G) 又名粘多糖 ( Mu2 copolysacchride) 、酸 性 粘 多 糖 ( Acid/ Acidic Mucopolysac2 charide) 、硫酸粘多糖 ( Sulphuric Mucopolysaccharide) 、硫酸酯 多糖 ( Sulphate Polysaccharide) 、结 缔 组 织 多 糖 ( Connective Tissue Polysaccharide) 等[1 ] ,它在许多生物学 、生理学和病理 学过程中起着重要作用 ,已引起世界医药界的广泛关注 ,人 们已经在利用外源性糖胺聚糖的生物活性研制有效药物防 治某些疾病方面取得了很大进展 。糖胺聚糖的功能与其结 构密切相关 ,关于多糖结构和功能关系的研究已经成为生 命科学最前沿的领域之一 ,许多先进的仪器分析方法和生 物技术已被应用到多糖的结构分析中 。目前对于糖胺聚糖 一级结构的研究已经取得了很大的进展 ,但是对于其高级 结构及其与功能活性的关系的研究还很少 ,本文综述了糖 胺聚糖的结构层次及结构分析方法 。
47
组织化学方法是测定糖胺聚糖最原始的方法 。Karls2 son[10 ]曾利用糖胺聚糖和阿尔辛蓝结合与分解的性能检测 糖胺聚糖含量 。后来 ,有利用阿尔辛蓝 (Alcian blue) [11 ] 、1 ,9 - 二甲基亚甲蓝 (1 ,9 - dimet hylmet hylene blue) [1 ] [12 ]和天青 A (azure A) [13 ]等染色剂直接比色法定性 、定量分析糖胺聚 糖 。阿尔辛蓝比色法灵敏度不及后两者 ,且在高盐溶液中 结果不够准确 ,但是可以应用于提取分离的初步筛选过程 中 。经过改进后的二甲基亚甲蓝比色法不仅灵敏度高 ,而 且稳定性和测量范围都得到了提高 。天青 A 比色法灵敏度 很高 ,但是反应条件要求高 。
己糖醛酸的测定方法有 Dische 法[25 ] 及其改进法[26 ] 和 Nelly 法[27 ] 。Dische 法即咔唑 —硫酸法已在己糖醛酸的测 定中被广泛运用 。但是由于上述方法都受到中性己糖和戊 糖的干扰 ,现在多采用间羟联苯法[28 ] 。
3 精细结构分析
3. 1 一级结构分析 3. 1. 1 主链基团测定
吸收蜂来判别β糖苷键的存在 。酶法[18 ]测定 D - / L - 构型 极其有效 ,近来已被研究者使用 。 2. 2. 2 己糖胺测定
糖胺聚糖水解后释放出的氨基己糖 ,常用 Elson - Mor2 gan 法[19 ]及其改进方法[20 ] 分析游离氨基己糖 ; N —乙酰氨 基己糖则常用 Morgan —Elson 法[21 ] 及其改进方法[22 ] 分析 。 在原大分子中 N —乙酰氨基己糖可用次氯酸钠 - 直链淀粉 - 碘 化 钾 法 测 定[16 ] 。其 它 测 定 方 法 还 有 离 子 交 换 色 谱 法[23 ] 、高效液相色谱法[24 ]等 。 2. 2. 3 己糖醛酸测定
第 24 卷第 5 期 2005 年 5 月
水产科学
FISHERIES SCIENCE
糖胺聚糖的分析测定方法
Vol. 24 No . 5 May. 2005
刘 义 , 钱 和
(江南大学食品学院 , 国家教育部功能食品工程研究中心 , 江苏 无锡 214036)
关键词 : 糖胺聚糖 ; 蛋白多糖 ; 硫酸酯多糖 ; 结构
2. 1 糖胺聚糖完整分子定性 、定量分析 2. 1. 1 分子量 、纯度分析
纸层析 、电泳技术已被广泛应用于糖胺聚糖组分纯度 的分析 ,常用的电泳有 :琼脂糖凝胶电泳 、醋酸纤维素膜电 泳 、SDS - PA GE 等[3 ] 。另外毛细管电泳[4 ] 、毛细管区带电 泳[5 ]已被用于糖胺聚糖整体分子 、寡聚体成分 、二糖单元的 分离与分析 。凝胶排阻色谱法和 HPLC 已经成为实验室分 析糖胺聚糖纯度 、分子量最为常规的方法 。 另外分析型超
β(1 →3) 、β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4) α(1 →3) 、β(1 →4) α/β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4)
硫酸基的位置 糖胺的 4 或 6 碳 糖胺的 6 碳 糖胺的 4 碳 糖胺的 1 或 3 或 6 碳 ;醛酸的 2 碳 无
2 糖胺聚糖分析测定方法
Kennedy[29 ]总结前人的研究成果认为大多数糖胺聚糖 是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据有 规则的排列形成的直链多糖 ,但其二糖单元也呈不均一性 。
将糖胺聚糖水解为寡糖和单糖 ,是分析多糖链组成成 分的主要手段 。水解方法包括完全酸水解 、部分酸水解 、乙 酰解 、甲醇解以及酶解等 。1) 完全酸水解 ;将多糖与强酸 (浓 硫酸 、浓盐酸) 等试剂作用 ,在一定温度下 (80～100 ℃) 进行 完全酸水解 (4～10 h) 。水解的难易程度与组成多糖的单糖 性质 、单糖环的形状和糖苷键的构型有关 。一般呋喃型较 吡喃型易水解 ,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解 。2) 部分 酸水解 :利用中性酸 (硫酸 、盐酸) 100 ℃水解合适时间 。3) 乙 酰解 ;将多糖与乙酐 、冰醋酸 、浓硫酸等混合反应 ,可得到乙 酰化单糖 。4) 甲醇解 :将多糖与盐酸 - 甲醇混合反应 ,可得 到甲基化单糖 。5) 酶解 :该技术已被广泛地应用于糖胺聚糖 组成成分 的 分 析 , 最 常 用 的 酶 有 软 骨 素 酶 AC、软 骨 素 酶 ABC 等 。对硫酸多糖进行酶解时 ,其硫酸基可能阻碍反应 的进行 ,因此在酶解之前必须有一个脱硫的步骤 。 3. 1. 2 取代基测定
表 1 糖胺聚糖的结构层次
糖胺聚糖
二糖单元组分
连接键
ຫໍສະໝຸດ Baidu
硫酸软骨素 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 硫酸角质素 半乳糖 、N - 乙酰葡萄糖胺 硫酸皮肤素 艾杜糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 肝 素 艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸 、硫酸葡萄糖胺或 N - 乙酰葡萄糖胺 透 明 质 酸 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰葡萄糖胺
总糖含量的测定采用 Dubios 法[7 ] 。 以分子中某一基团的含量来定量糖胺聚糖的方法有 : 测定己糖醛酸的 Carbazole 法[8 ] 、测定己糖胺的 Elson - Mor2 gan 法[9 ] 。两种方法都要用强腐蚀性酸 ,且反应需在高温下 进行 。
第5期
刘义等 :糖胺聚糖分析测定方法
Smit h 降解 :Smit h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进 行酸水解或部分水解 。由于糖基之间以不同的位置缩合 , 用高碘酸氧化后则生成不同的产物 ,由降解产物来获取多 糖的结构信息 。
甲基化反应 : 将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全 部甲基化 ,进而将甲基化多糖水解 ,水解后得到的化合物 , 其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点 。根据不同 甲基化单糖的比例 ,可以推测这种连接键型在多糖重复结 构中 的 比 例 。多 糖 的 甲 基 化 方 法 较 多 , 有 Purdie 法 、 Hamort h 法 、Menzics 法 、Hakomori 法等 ;目前 ,最常用的甲基 化方法是改良的 Hakomori 法[33 ] 。甲基化反应的关键在于 甲基化完全 ,通常采用红外光谱法来检测 3500cm - 1处有无 吸收来判断 。多糖甲基化完全后 ,水解成甲基化单糖 ,经乙 酰化后用 GC 或 GC - MS 分析 ,也可用 HPLC 直接分析 。
收稿日期 : 2004 - 07 - 30 ; 修回日期 : 2004 - 10 - 081 作者简介 : 刘义 (1981 - ) ,男 ,在读硕士研究生.
速离心机也被用于糖胺聚糖分子量的测定[6 ] 。 此外 ,紫外分光光度计在 280 nm 处有无吸收常用来判
断多糖样品是否含有蛋白质 。 2. 1. 2 定量检测
CTAB 和 CPC 等[14 ]季铵盐不仅能够用来实现糖胺聚糖 的分离提取 ,而且还被用于糖胺聚糖的定量分析 。
色谱法和电泳法也可用于糖胺聚糖的定量检测 ,但该 法不适合常规分析 。 2. 1. 3 其他
糖胺聚糖聚合物联接稳定性的测定[6 ] :在物理条件下 , 糖胺聚糖和透明质酸之间的相互作用是可逆的 ,而由糖胺 聚糖 、透明质酸和结合蛋白形成的具有三级结构的复合物 恰恰是不可逆的 。因此 ,将过量的透明质酸和糖胺聚糖混 合后过柱 ,那些与透明质酸结合不紧密的糖胺聚糖就滞留 在柱中 ,反之与透明质酸结合紧密的糖胺聚糖就优先被洗 脱出来 ,然后根据洗脱结果计算糖胺聚糖聚合物联接稳定 性的大小 。
糖胺聚糖的取代基通常包括羧基 、硫酸基和乙酰氨基 等。
在乙酰基的测定方法中 ,气相色谱法较灵敏 。测定时 乙酰基用酸解离成乙酸后 ,将水解液直接注入色谱柱进行 测定[30 ] 。[ 1 H ] 核 磁 共 振 可 用 于 完 整 分 子 中 乙 酰 基 的 测 定[24 ] 。
硫酸根测定 :Dodgson 和 Lloyd 曾分别利用对二氨基联 苯和氯冉酸钡测定硫酸根 ,但受联氨影响较大 。后来 ,Dodg2 son 等[31 ]用重量法测定无机硫酸根 ,但实验所需样品量较 大 ,不能进行微量测定 。1961 年 Dodgson[32 ] 将 BaCl2 - 明胶
文章编号 : 100321111 (2005) 0520046204
1 糖胺聚糖的结构层次[2]
糖胺聚糖结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂 ,可以 说是最复杂的生物大分子 。糖胺聚糖的一级结构是指糖基 的组成 、糖基排列顺序 、相邻糖基的连接方式 、异头碳构型 以及糖链有无分支 、分支的位置与长短等 。大多数糖胺聚 糖是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据 有规则的排列形成的直链多糖 。但需注意的是其二糖单元 也呈不均一性 (见表 1) 。糖胺聚糖的二级结构是指多糖骨 架链间以氢键结合的各种聚合体 。糖胺聚糖链一级结构的 重复顺序 ,由于糖单位的羟基 、羧基 、氨基以及硫酸基之间 的非共价相互作用 ,导致有序的二级结构空间有规则而粗 大的构象 ,即是糖胺聚糖链的三级结构 。糖胺聚糖的四级 结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体 。
以前定性单糖都是应用经典的化学 、物理方法 ,现在已 经建立了多种快速简便定性 、定量分析单糖的方法 。
纸层析 ( PC) 、薄层层析 ( TLC) 都是以已知结构的单糖 作为标准物 ,根据保留时间等特征数值来判断单糖的种类 。 气相 ( GC) 分析时先将单糖衍生化处理成易挥发的组分 ,常 采用的衍生化方法有硅烷基化和乙酰化 。高效液相色谱法 ( HPLC) 则克服了 GC 需衍生化的缺陷 ,它可直接进样测定 。 同样离子色谱法不需要衍生化处理 ,而且检测灵敏度甚至 比 HPLC 更高 。质谱 ( MS) 和核磁共振 (NMR) 常用于单糖 和多糖精细结构的研究 ,气相 —质谱已应用于甲基化产物 的鉴别 。
己糖构型测定[16 ] :糖类物质中手性原子较多 ,其旋光性 与其空间构型也有关 ,一般我们可以由旋光度值直接判断 单糖为α型还是β型 ,通常β型单糖旋光度值较α型负很 多 。比较α糖酶和β糖酶对多糖降解效果 ,也可得出糖胺聚 糖中某一单糖主要以何种构型存在[2 ,17 ] 。糖胺聚糖红外光 谱图中 ,890cm - 1 吸收蜂来判别α糖苷键的存在 ,840cm - 1
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水产科学
第 24 卷
比浊法应用于糖类和酯类水解产物中无机硫酸根的测定之 后 ,现在该法已被普遍应用于糖胺聚糖硫酸根的定量分析 。 3. 1. 3 主链及侧链联接方式
高碘酸氧化 : 高碘酸可以选择性地氧化断裂糖分子中 的连二羟基或连三羟基 ,生成相应的多糖醛 、甲酸 ,反应定 量地进行 。每开裂一个 C —C 键消耗一分子高碘酸 ,通过测 定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量 ,可以判断糖苷键的位 置 、连接方式 、支链状况和聚合度等结构信息 。高碘酸氧化 反应必须在控制的条件下进行 ,以避免副反应的产生 (超氧 化反应) 。一般使多糖与最小量的高碘酸反应 ,溶液 p H 值 控制在 3～5 ,且应避光 、低温 。
中图分类号 : Q538
文献标识码 : C
糖胺聚糖 ( Glycosaminoglycan , GA G) 又名粘多糖 ( Mu2 copolysacchride) 、酸 性 粘 多 糖 ( Acid/ Acidic Mucopolysac2 charide) 、硫酸粘多糖 ( Sulphuric Mucopolysaccharide) 、硫酸酯 多糖 ( Sulphate Polysaccharide) 、结 缔 组 织 多 糖 ( Connective Tissue Polysaccharide) 等[1 ] ,它在许多生物学 、生理学和病理 学过程中起着重要作用 ,已引起世界医药界的广泛关注 ,人 们已经在利用外源性糖胺聚糖的生物活性研制有效药物防 治某些疾病方面取得了很大进展 。糖胺聚糖的功能与其结 构密切相关 ,关于多糖结构和功能关系的研究已经成为生 命科学最前沿的领域之一 ,许多先进的仪器分析方法和生 物技术已被应用到多糖的结构分析中 。目前对于糖胺聚糖 一级结构的研究已经取得了很大的进展 ,但是对于其高级 结构及其与功能活性的关系的研究还很少 ,本文综述了糖 胺聚糖的结构层次及结构分析方法 。
47
组织化学方法是测定糖胺聚糖最原始的方法 。Karls2 son[10 ]曾利用糖胺聚糖和阿尔辛蓝结合与分解的性能检测 糖胺聚糖含量 。后来 ,有利用阿尔辛蓝 (Alcian blue) [11 ] 、1 ,9 - 二甲基亚甲蓝 (1 ,9 - dimet hylmet hylene blue) [1 ] [12 ]和天青 A (azure A) [13 ]等染色剂直接比色法定性 、定量分析糖胺聚 糖 。阿尔辛蓝比色法灵敏度不及后两者 ,且在高盐溶液中 结果不够准确 ,但是可以应用于提取分离的初步筛选过程 中 。经过改进后的二甲基亚甲蓝比色法不仅灵敏度高 ,而 且稳定性和测量范围都得到了提高 。天青 A 比色法灵敏度 很高 ,但是反应条件要求高 。
己糖醛酸的测定方法有 Dische 法[25 ] 及其改进法[26 ] 和 Nelly 法[27 ] 。Dische 法即咔唑 —硫酸法已在己糖醛酸的测 定中被广泛运用 。但是由于上述方法都受到中性己糖和戊 糖的干扰 ,现在多采用间羟联苯法[28 ] 。
3 精细结构分析
3. 1 一级结构分析 3. 1. 1 主链基团测定
吸收蜂来判别β糖苷键的存在 。酶法[18 ]测定 D - / L - 构型 极其有效 ,近来已被研究者使用 。 2. 2. 2 己糖胺测定
糖胺聚糖水解后释放出的氨基己糖 ,常用 Elson - Mor2 gan 法[19 ]及其改进方法[20 ] 分析游离氨基己糖 ; N —乙酰氨 基己糖则常用 Morgan —Elson 法[21 ] 及其改进方法[22 ] 分析 。 在原大分子中 N —乙酰氨基己糖可用次氯酸钠 - 直链淀粉 - 碘 化 钾 法 测 定[16 ] 。其 它 测 定 方 法 还 有 离 子 交 换 色 谱 法[23 ] 、高效液相色谱法[24 ]等 。 2. 2. 3 己糖醛酸测定
第 24 卷第 5 期 2005 年 5 月
水产科学
FISHERIES SCIENCE
糖胺聚糖的分析测定方法
Vol. 24 No . 5 May. 2005
刘 义 , 钱 和
(江南大学食品学院 , 国家教育部功能食品工程研究中心 , 江苏 无锡 214036)
关键词 : 糖胺聚糖 ; 蛋白多糖 ; 硫酸酯多糖 ; 结构
2. 1 糖胺聚糖完整分子定性 、定量分析 2. 1. 1 分子量 、纯度分析
纸层析 、电泳技术已被广泛应用于糖胺聚糖组分纯度 的分析 ,常用的电泳有 :琼脂糖凝胶电泳 、醋酸纤维素膜电 泳 、SDS - PA GE 等[3 ] 。另外毛细管电泳[4 ] 、毛细管区带电 泳[5 ]已被用于糖胺聚糖整体分子 、寡聚体成分 、二糖单元的 分离与分析 。凝胶排阻色谱法和 HPLC 已经成为实验室分 析糖胺聚糖纯度 、分子量最为常规的方法 。 另外分析型超
β(1 →3) 、β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4) α(1 →3) 、β(1 →4) α/β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4)
硫酸基的位置 糖胺的 4 或 6 碳 糖胺的 6 碳 糖胺的 4 碳 糖胺的 1 或 3 或 6 碳 ;醛酸的 2 碳 无
2 糖胺聚糖分析测定方法
Kennedy[29 ]总结前人的研究成果认为大多数糖胺聚糖 是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据有 规则的排列形成的直链多糖 ,但其二糖单元也呈不均一性 。
将糖胺聚糖水解为寡糖和单糖 ,是分析多糖链组成成 分的主要手段 。水解方法包括完全酸水解 、部分酸水解 、乙 酰解 、甲醇解以及酶解等 。1) 完全酸水解 ;将多糖与强酸 (浓 硫酸 、浓盐酸) 等试剂作用 ,在一定温度下 (80～100 ℃) 进行 完全酸水解 (4～10 h) 。水解的难易程度与组成多糖的单糖 性质 、单糖环的形状和糖苷键的构型有关 。一般呋喃型较 吡喃型易水解 ,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解 。2) 部分 酸水解 :利用中性酸 (硫酸 、盐酸) 100 ℃水解合适时间 。3) 乙 酰解 ;将多糖与乙酐 、冰醋酸 、浓硫酸等混合反应 ,可得到乙 酰化单糖 。4) 甲醇解 :将多糖与盐酸 - 甲醇混合反应 ,可得 到甲基化单糖 。5) 酶解 :该技术已被广泛地应用于糖胺聚糖 组成成分 的 分 析 , 最 常 用 的 酶 有 软 骨 素 酶 AC、软 骨 素 酶 ABC 等 。对硫酸多糖进行酶解时 ,其硫酸基可能阻碍反应 的进行 ,因此在酶解之前必须有一个脱硫的步骤 。 3. 1. 2 取代基测定
表 1 糖胺聚糖的结构层次
糖胺聚糖
二糖单元组分
连接键
ຫໍສະໝຸດ Baidu
硫酸软骨素 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 硫酸角质素 半乳糖 、N - 乙酰葡萄糖胺 硫酸皮肤素 艾杜糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 肝 素 艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸 、硫酸葡萄糖胺或 N - 乙酰葡萄糖胺 透 明 质 酸 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰葡萄糖胺
总糖含量的测定采用 Dubios 法[7 ] 。 以分子中某一基团的含量来定量糖胺聚糖的方法有 : 测定己糖醛酸的 Carbazole 法[8 ] 、测定己糖胺的 Elson - Mor2 gan 法[9 ] 。两种方法都要用强腐蚀性酸 ,且反应需在高温下 进行 。
第5期
刘义等 :糖胺聚糖分析测定方法
Smit h 降解 :Smit h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进 行酸水解或部分水解 。由于糖基之间以不同的位置缩合 , 用高碘酸氧化后则生成不同的产物 ,由降解产物来获取多 糖的结构信息 。
甲基化反应 : 将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全 部甲基化 ,进而将甲基化多糖水解 ,水解后得到的化合物 , 其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点 。根据不同 甲基化单糖的比例 ,可以推测这种连接键型在多糖重复结 构中 的 比 例 。多 糖 的 甲 基 化 方 法 较 多 , 有 Purdie 法 、 Hamort h 法 、Menzics 法 、Hakomori 法等 ;目前 ,最常用的甲基 化方法是改良的 Hakomori 法[33 ] 。甲基化反应的关键在于 甲基化完全 ,通常采用红外光谱法来检测 3500cm - 1处有无 吸收来判断 。多糖甲基化完全后 ,水解成甲基化单糖 ,经乙 酰化后用 GC 或 GC - MS 分析 ,也可用 HPLC 直接分析 。
收稿日期 : 2004 - 07 - 30 ; 修回日期 : 2004 - 10 - 081 作者简介 : 刘义 (1981 - ) ,男 ,在读硕士研究生.
速离心机也被用于糖胺聚糖分子量的测定[6 ] 。 此外 ,紫外分光光度计在 280 nm 处有无吸收常用来判
断多糖样品是否含有蛋白质 。 2. 1. 2 定量检测
CTAB 和 CPC 等[14 ]季铵盐不仅能够用来实现糖胺聚糖 的分离提取 ,而且还被用于糖胺聚糖的定量分析 。
色谱法和电泳法也可用于糖胺聚糖的定量检测 ,但该 法不适合常规分析 。 2. 1. 3 其他
糖胺聚糖聚合物联接稳定性的测定[6 ] :在物理条件下 , 糖胺聚糖和透明质酸之间的相互作用是可逆的 ,而由糖胺 聚糖 、透明质酸和结合蛋白形成的具有三级结构的复合物 恰恰是不可逆的 。因此 ,将过量的透明质酸和糖胺聚糖混 合后过柱 ,那些与透明质酸结合不紧密的糖胺聚糖就滞留 在柱中 ,反之与透明质酸结合紧密的糖胺聚糖就优先被洗 脱出来 ,然后根据洗脱结果计算糖胺聚糖聚合物联接稳定 性的大小 。
糖胺聚糖的取代基通常包括羧基 、硫酸基和乙酰氨基 等。
在乙酰基的测定方法中 ,气相色谱法较灵敏 。测定时 乙酰基用酸解离成乙酸后 ,将水解液直接注入色谱柱进行 测定[30 ] 。[ 1 H ] 核 磁 共 振 可 用 于 完 整 分 子 中 乙 酰 基 的 测 定[24 ] 。
硫酸根测定 :Dodgson 和 Lloyd 曾分别利用对二氨基联 苯和氯冉酸钡测定硫酸根 ,但受联氨影响较大 。后来 ,Dodg2 son 等[31 ]用重量法测定无机硫酸根 ,但实验所需样品量较 大 ,不能进行微量测定 。1961 年 Dodgson[32 ] 将 BaCl2 - 明胶
文章编号 : 100321111 (2005) 0520046204
1 糖胺聚糖的结构层次[2]
糖胺聚糖结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂 ,可以 说是最复杂的生物大分子 。糖胺聚糖的一级结构是指糖基 的组成 、糖基排列顺序 、相邻糖基的连接方式 、异头碳构型 以及糖链有无分支 、分支的位置与长短等 。大多数糖胺聚 糖是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据 有规则的排列形成的直链多糖 。但需注意的是其二糖单元 也呈不均一性 (见表 1) 。糖胺聚糖的二级结构是指多糖骨 架链间以氢键结合的各种聚合体 。糖胺聚糖链一级结构的 重复顺序 ,由于糖单位的羟基 、羧基 、氨基以及硫酸基之间 的非共价相互作用 ,导致有序的二级结构空间有规则而粗 大的构象 ,即是糖胺聚糖链的三级结构 。糖胺聚糖的四级 结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体 。