从生物样品中分离纯化生物大分子
生物样品中生物大分子的分离纯化
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（六） 生物大分子的抽提
✓ “抽提”是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一 定条件下和溶剂中，使被提取的生物大分子以溶解状态 充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。
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组织与细胞破碎
1、机械破碎法
✓ 研磨：这种方法比较柔和，适宜实验室使用； ✓ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法。利用高速
旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。处理材料量较大 时，经常使用。 ✓ 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细 胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、 多聚糖等。
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生物大分子分离纯化的特殊性
1. 生物材料的组成复杂，种类极多；分离纯化方法千 差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大 分子的分离制备。
2. 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤多，流程长。
生物产品分离纯化技术
生物产品分离纯化技术
生物产品分离纯化技术是指将从生物系统中提取或获得的混合物或复杂混合物中的生物分子分离和纯化的一系列技术和方法。
这些技术包括但不限于以下几种：
1.色谱技术：如凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等，可用于分离和纯化蛋白质、核酸、代谢产物等生物大分子。
2.超滤技术：可用于分离和纯化多糖、蛋白质、核酸等小分子。
3.亲和层析技术：利用配对结合剂将特定蛋白质、酶等生物大分子与树脂表面结合，实现富集和纯化。
4.透析技术：如透析膜、透析柱等，可用于分离和富集生物大分子。
5.离心技术：如高速离心机、超高速离心机等，可用于分离和纯化细胞、亚细胞组分等微小生物颗粒。
6.电泳技术：如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转移蛋白电泳等，可用于分离和纯化蛋白质、核酸等生物大分子。
这些技术的选用取决于具体的分离纯化目的和样品特性，以及实验条件和要求。
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纯化实验员岗位职责是什么
纯化实验员岗位职责是什么
纯化实验员是生物制药企业中重要的职位之一。
他们主要负责从生物制品中分离纯化目标蛋白质或其他生物大分子。
纯化实验员通常在实验室中工作，需要熟悉各种生命科学和化学技术，以及灭菌、实验操作、仪器维护等方面的知识和技能。
具体的职责包括：
1. 实验室准备：纯化实验员需要准备实验室物料和仪器设备，确保实验室设备和仪器处于良好的工作状态；
2. 分离纯化目标分子：纯化实验员使用各种化学和生物学技术，如柱层数组技术、电泳、膜分离、毒素结合等，从生物样品中分离纯化目标蛋白质或其他生物大分子；
3. 分析和鉴定：纯化实验员需要使用不同的分析技术，如质谱、光谱、电泳等，来检测并确定目标分子的纯度和活性；
4. 数据记录和分析：纯化实验员需要记录实验数据及其结果，并进行统计和分析，以评估实验的准确性和可靠性；
5. 实验室安全和卫生：纯化实验员需要遵守实验室安全和卫生规定，确保实验室不受到污染和危险物质的侵害；
6. 团队合作：纯化实验员需要与其他实验室成员密切合作，如项目经理、研究员、技术专家等，确保实验工作的顺利进行，达成团队的目标。
纯化实验员需要具备较高的实验技能和知识水平，以及良好的团队合作能力和沟通能力。
企业需要招聘有经验和资质认证的纯化实验员，以确保生产过程中的质量和效率。
生物大分子的纯化和结构分析
生物大分子的纯化和结构分析在生物学研究中，大分子是一个非常重要的研究对象。
它们是生物体内一些重要的分子，如蛋白质、核酸、糖类等。
这些大分子的复杂性和多样性使得它们的纯化和结构分析非常具有挑战性。
本文将探讨生物大分子的纯化和结构分析的基本原理和方法。
一、生物大分子的纯化生物大分子的纯化是生物学研究中的一个基础性实验步骤，也是研究生物大分子结构和功能的前提。
生物大分子的纯化就是把它们从其他生物体内分子中分离出来，使其达到一定的纯度，以满足后续的结构和功能研究需要。
其中，蛋白质纯化是生物学研究中的一个重要问题之一，因为蛋白质是生物体内最为重要的大分子之一。
1.1 分离方法生物大分子的纯化需要一系列的实验分离步骤。
根据大分子的化学性质和生物来源不同，分离方法也有所不同。
主要的方法包括：（1）分子排斥色谱（size exclusion chromatography）：根据分子的大小分离。
（2）离子交换色谱（ion exchange chromatography）：根据分子的电荷差异分离。
（3）亲和色谱（affinity chromatography）：根据分子的特异配体分离。
（4）逆向相色谱（reverse-phase chromatography）：根据分子的疏水性分离。
1.2 纯度检测生物大分子的纯度检测是生物学研究中的一个关键环节。
生物大分子的结构和功能的研究都需要高纯度的样品。
目前常用的纯度检测方法有：（1）SDS-PAGE：钠二十硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（2）Western blotting：蛋白质的免疫印迹。
（3）UV吸收光谱：在280纳米处进行吸光度检测。
二、生物大分子的结构分析生物大分子的结构分析是生物学研究中一个非常重要的研究领域，因为分子的结构直接关系到其功能。
目前，生物大分子的结构分析主要有两种方法：晶体学和核磁共振。
2.1 晶体学晶体学是生物大分子结构分析的传统方法。
该方法要求分子能够形成晶体，然后通过X射线衍射得到分子的三维结构。
生物大分子分离提取操作的基本流程
生物大分子分离提取操作的基本流程1.生物大分子分离提取操作是生物化学领域中的一项重要实验技术。
Biological macromolecule separation and extraction is an important experimental technique in the field of biochemistry.2.首先，需要将生物样品进行破碎和细胞裂解。
First, the biological sample needs to be broken and the cells need to be lysed.3.破碎和裂解的方法可以是超声波破碎、高速离心或化学裂解。
Methods for breaking and lysing can include ultrasonic disruption, high-speed centrifugation, or chemical lysis.4.接着，利用差速离心或超速离心将混合物进行沉淀分离。
Then, the mixture is separated by differential centrifugation or ultra-speed centrifugation to precipitate.5.沉淀后的物质可以通过离心、过滤或柱层析进一步分离提取。
The precipitated material can be further separated and extracted through centrifugation, filtration, or column chromatography.6.不同的分子大小和性质可以采用不同的分离技术。
Different separation techniques can be used for molecules of different sizes and properties.7.一些生物大分子需要进行蛋白质酶消化或聚合酶链式反应后再进行分离提取。
生物大分子的纯化与鉴定技术
生物大分子的纯化与鉴定技术生物大分子是生命体内最基本的组成元素之一，包括蛋白质、核酸、多糖和脂质等。
它们的结构和功能对于生物体的发育、代谢、传递遗传信息等方方面面都有着非常重要的作用。
因此，对它们进行纯化和鉴定是生物学和生命科学研究中不可或缺的重要步骤。
一、蛋白质的纯化与鉴定技术1. 活性层析技术活性层析是从混合样品中纯化蛋白质的一种常用技术。
它基于蛋白质与特定配体之间的互相作用，利用这种相互作用把想要纯化的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法不仅可以分离出单一种类的蛋白质，还可以根据蛋白质与配体的亲和性进行分层次纯化。
同时，利用不同的配体也能够分离出不同功能的酶，从而进一步扩大了对蛋白质的纯化范围。
2. 离子交换层析技术离子交换层析是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
它利用固定在树脂表面上的离子，通过与蛋白质表面的离子相互作用，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常用于分离带有不同电荷的蛋白质，以及酸性和碱性细胞因子等物质。
3. 尺寸排除层析技术尺寸排除层析技术是一种基于蛋白质大小的分离方法。
它通过让大分子在固定相中的孔隙中滞留时间长，从而将大分子和小分子分离出来。
这种方法通常用于分离相对分子质量较大的蛋白质，如重组蛋白、抗体等。
4. 逆相高效液相色谱技术逆相高效液相色谱是一种基于蛋白质亲水性的分离方法。
它利用逆相柱的反相作用，将亲水性较小的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常被用于提纯高表达体系中的蛋白质。
5. SDS-PAGE和Western Blotting技术SDS-PAGE是一种基于蛋白质质量和电荷的分离技术，通过在凝胶中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂，可以使不同电荷和大小的蛋白质变得相同，从而进行准确的大小分离。
Western Blotting是一种检测蛋白质表达的方法，它利用特异性抗体将蛋白质分子分离出来，并将其转移到膜上，然后通过特异性抗体进一步检测目标蛋白质的表达量。
二、核酸的纯化与鉴定技术1. 常规离心技术常规离心技术是一种对复杂混合物进行分离和预纯化的方法，通过调整离心速度和离心时间，将不同大小和形状的细胞组分分离出来。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。
此外，功能地也可以应用于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。
对于蛋白质，离心分离是一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。
因为蛋白质它们有不同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。
这个过程使用一种特定的介质，该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。
这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。
这两种技术的精确度取决于集成柱的大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。
有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。
选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究生物大分子的分离纯化与鉴定是生物学研究中非常重要的一步。
合理选择适用的方法能够高效地分离纯化目标物质，可帮助研究者深入了解其结构和功能。
本文将介绍几种常用的生物大分子分离纯化与鉴定方法。
一、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的生物大分子分离方法。
通过电场的作用，将样品中的生物大分子按照尺寸或电荷迁移，从而实现分离。
常见的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）等。
PAGE适用于蛋白质的分离纯化，而琼脂糖凝胶电泳适用于DNA和RNA的分离纯化。
二、超速离心法超速离心法是利用离心机产生高速转动，使样品中的物质根据其密度和大小差异分层离心的一种方法。
通过超速离心可以实现生物大分子的纯化，如蛋白质的沉淀、核酸的沉淀等。
超速离心法可以快速分离不同密度或不同分子量的生物大分子，得到纯度较高的目标物质。
三、气相色谱法（Gas chromatography）气相色谱法是一种常用的化合物分离和定量分析方法，常用于分离和鉴定挥发性或半挥发性有机化合物。
该方法主要通过样品在固定相与流动相共同作用下，依据不同的分配系数在色谱柱中发生分离。
气相色谱法广泛应用于有机化学、环境监测、食品安全等领域。
四、质谱法（Mass Spectrometry）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。
它主要通过测量被测目标物质的质荷比，进而得到目标物质的质量信息和结构信息。
质谱法在生物学研究中被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学等领域，可用于分析和鉴定复杂生物样品中的分子。
五、核磁共振法（Nuclear Magnetic Resonance）核磁共振法是一种常用的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。
它主要通过利用物质在外加磁场下核自旋进动特性的不同来获得物质的结构和性质信息。
核磁共振法在生物学研究中广泛应用于蛋白质结构研究、代谢组学等领域。
生物大分子的分离纯化和鉴定
利用溶解度差异 进行分离纯化
利用电荷性质进 行分离纯化
利用生物活性进 行分离纯化
分离纯化的过程
分离纯化的目的：去除杂质， 获得高纯度的生物大分子
分离纯化的方法：沉淀法、色 谱法、电泳法等
分离纯化的原理：利用生物大 分子在物理性质、化学性质等 方面的差异进行分离
分离纯化的流程：样品制备、 粗分离、精制纯化、产物检测
高效液相色谱法：随着技术的不断改进， 液相色谱法的分离效果和鉴定准确性得到 显著提高。
毛细管电泳技术：具有高效、快速、高分 辨率的特点，成为生物大分子分离纯化的 重要手段。
质谱技术：随着蛋白质组学研究的深入， 质谱技术在生物大分子鉴定中发挥着越来 越重要的作用。
生物信息学方法：通过计算机技术对生 物大分子数据进行处理和分析，为生物 大分子的分离纯化和鉴定提供了有力支 持。
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法：通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法：利 用抗体与抗原的 特异性结合，对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法： 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响， 确定其结构和功 能。
分子生物学方法： 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
随着新材料的出现和应用，将会有更多高效、低成本的分离纯化材料应用 于实际操作中。
人工智能和机器学习等先进技术的应用，将有助于提高生物大分子分离纯 化和鉴定的自动化程度和智能化水平。
生物大分子分离纯化和鉴定技术将与生物信息学、系统生物学等学科交叉 融合，形成更加全面和深入的研究和应用领域。
05
生物大分子分离纯化和鉴定的应用领域
酶工程：通过分离 纯化技术获取酶， 用于酶催化反应研 究和酶制剂的生产 。
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究随着人类对生命科学的研究与深入，生物大分子在生命科学领域中发挥着越来越重要的作用。
然而，想要从复杂的生物体系中获取纯净的生物大分子是一项相当艰巨的任务。
在化学反应中，为了获取纯净的产物，我们可以通过一系列的化学反应、溶剂萃取、蒸馏、结晶等步骤来进行分离纯化。
类似地，生物大分子也需要专业的分离纯化技术来获得单一、纯净的样品。
本文将重点介绍当前常用的生物大分子分离纯化技术及其应用研究。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）也称为分子筛层析法，是其中的一种分离技术，是利用分子筛过滤作用，通过大小分离生物大分子的方法。
也就是说，当一个混合物在溶液中进行层析时，它们将按大小顺序逐渐与凝胶内的微孔隔离出来。
而较大的生物大分子将无法通过凝胶微孔，而较小的物质则可随着溶液进一步深入凝胶内部，最终通过洗脱。
凝胶过滤层析法的主要优点是操作简单，具有较好的纯化效果。
它特别适用于大分子的纯化，例如酶、蛋白质、多肽、高分子以及其它具有不同分子量的物质混合物的分离。
凝胶过滤层析法被广泛应用于生物学、有机化学、生物制药等领域。
二、离子交换层析法离子交换层析法（Ion-exchange chromatography），是指利用固定正、负离子的功能基团，与可带电荷的分子间的相互作用力，实现对样品分离纯化的技术。
离子交换层析法的选择与离子交换柱的理化性质、样品离子性质和操作条件有关。
离子交换层析法的主要优点是它是一种高效、简便、快速并且基本上不损害生物大分子的分离纯化方法。
在生物大分子的纯化过程中，如果杂质物质与目标物质都带有电荷，离子交换层析是非常好的选择。
离子交换层析可以用于酸性、碱性、中等等多种环境下的分离纯化。
三、膜过滤分离技术膜过滤技术（Membrane Filtration）是指利用膜的结构及其物理化学理性，在分离过程中分离溶液体系。
生物大分子的分离和纯化技术
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。
要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行分离和纯化。
生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。
生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。
其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离出来，并得到相对纯度较高的产物。
目前，生物大分子的分离和纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。
凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。
在这种方法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。
因此，随着溶液通过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。
这种方法适用于大小分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。
在这种方法中，一种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。
这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的分离，如蛋白质。
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。
在这种方法中，一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。
例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂有特异结合关系的目标分子。
这种方法适用于具有高度特异性活性的生物大分子的纯化。
尺寸排除层析是一种基于分子形状的分离方法。
在这种方法中，一种具有多孔性的材料被用来吸附目标分子，具有大分子尺寸和形状的目标分子沿着孔隙穿过，而具有小分子尺寸的分子则通过孔隙空隙。
这种方法常用于分离蛋白质和糖类等生物大分子。
逆向相色谱层析是一种基于亲水性的分离方法。
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3）透析法纯化过氧化氢酶:将沉淀重溶于 0.05mol/L旳磷酸缓冲液(pH=7.2) 中, 4 ℃ 透析过夜,然后按1∶1旳百分比向透析液中 加入预冷旳正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜. 然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇 层,反复2次,得粗酶液.
2.DEAE2Sep haro se 离子互换层析： 用磷酸缓冲液(0.05 mol/ L , p H =7.2) 平衡 至少4 倍柱体积(20 mL) , 上样5 mL . 用0～1 mol/ LNaCl溶液(含0.05 mol/ L , p H =7.2 旳 磷酸缓冲液) 进行梯度洗脱, 流速30 mL/ h , 每管搜集5 mL , 紫外监测波长为280 nm ; 测 定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量; 搜集活 性较高旳各管酶液, 4 ℃透析过夜, 冷冻干燥 后进行凝胶过滤.
1.粗酶液旳制备：1）称取新鲜鸭肝100 g , 用自来水 洗净, 再用消毒双蒸水漂洗洁净. 按1:5 旳百分比加 入预冷旳0.05 mol/ L 旳磷酸缓冲液(p H 7.2) , 用高 速组织捣碎机捣碎, 置于4 ℃冰箱抽提2 h ; 离心(6 000 r/ min ,4 ℃, 30 min) , 搜集上清液。 2）盐析法粗提过氧化氢酶:加入硫酸铵至40 %饱和 度, 离心(6 000 r/ min , 4 ℃, 30 min) 去沉淀, 上清中 再加硫酸铵至60 %饱和度, 离心搜集沉淀。
试验原理
1.离子互换层析原理:固定相为离子互换剂， 是利用离子互换剂对多种离子有不同旳亲 和力，来分离混合物中多种离子旳层析技 术。
2.凝胶过滤层析原理:也称分子筛层析、排阻 层析。是利用具有网状构造旳凝胶旳分子 筛作用，根据被分离物质旳分子大小不同 来进行分离。
3.电泳法旳基本原理:电泳（electrophoresis）是指 带电荷旳溶质或粒子在电场中向着与其本身所带 电荷相反旳电极移动旳现象。物质分子在正常情 况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不 显示带电性。但是在一定旳物理作用或化学反应 条件下，某些物质分子会成为带电旳离子（或粒 子）。不同旳物质，因为其带电性质、颗粒形状 和大小不同，因而在一定旳电场中它们旳移动方 向和移动速度也不同，所以可使它们分离。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）1. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
生物大分子的分离纯化和鉴定技术
生物大分子的分离纯化和鉴定技术随着生物技术的发展，分离纯化和鉴定生物大分子是生物学、生物医学、生命科学等领域研究的重要方面。
在生物大分子分离纯化和鉴定技术中，以蛋白质的分离纯化和鉴定为例，包括以下几个主要步骤：试样的制备及萃取、分子分离、柱层析、电泳分离、质谱分析等。
试样的制备及萃取是生物大分子分离纯化和鉴定的第一步。
一个完整的蛋白质需要在生物体内经历多种化学和生物反应形成。
蛋白质可能存在于不同的组织或细胞器中，不同的蛋白质在组织中的含量、位置、形态都不尽相同，因此生物大分子分离纯化的前提是制备纯净、易提取的试样。
一般常用的萃取方法有裂解、离心、超声浸提、酸碱提取、酶解等。
分子分离是体现生物大分子分离纯化和鉴定技术的重要环节之一。
在实验中常用常数电泳、等一性电泳、双向电泳、斑点电泳等分子分离技术。
以SDS-PAGE为例，它是一种分子量分离方法。
SDS可以使蛋白质变成带有负电荷的孤立小球状，通过电泳在凝胶中不同的位置被分离出来。
凝胶中的蛋白质可以通过银染、荧光染、铜染等方法进行染色，进一步鉴定蛋白质的纯度和含量。
柱层析是生物大分子纯化中最常用的方法之一。
它是一种基于分子质量、三维结构、电性和亲水性等差异性进行分离的技术。
蛋白质在柱中经历吸附、洗脱、洗脱收集等步骤，以达到分离纯化的目的。
常用的柱层析有离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
电泳分离是生物大分子鉴定的重要技术手段。
电泳分离可以通过分子量、电荷等特性鉴定分离出来的生物大分子。
其中，一维电泳和二维电泳是常用的方法。
一维电泳可以鉴定蛋白质的分子量和离子电荷；二维电泳可以在不同机理下鉴定蛋白质的组分，如等电点和分子量。
质谱分析是生物大分子鉴定中的重要手段之一。
里面也涉及到如飞行时间质谱、液体质谱、质能分析谱等多种方法。
通过这些手段可以利用分子的大小、形状、结构和质量等特性进行鉴定，判断分子中存在的元素、结构和它们之间的关系。
这种方法准确性高，操作性好，用于分子鉴定的应用很多。
生物大分子的分离纯化技术
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
1. 确定要制备的生物大分子的目的和要求。 2. 建立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的 关键。
3. 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的 产物的物理化学性质。 4. 生物材料的破碎和预处理。
5. 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
6. 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要 求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或 HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
分析测定的方法主要有两类：
即生物学和物理、化学的测定方法。 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱 法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度 法）、电泳法、以及核磁共振等。
生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含 量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪 法等；
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更 加快速、简便。
抽提有效成分的影响因子
• 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极
性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。 因此选择抽提液必须考虑这些因素。
(1)溶剂的极性和离子强度：
有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中 稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度 的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存 在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖 水溶液。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似 相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响 溶质的溶解度。 降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜， 二甲基甲酰氨。
三 、 生物大分子的提取（抽提）
（一）抽提的含义 “抽提”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的 细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地 释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。
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3.2目标酶的初步提取：
原理：提取酶的方法有多种，但因为酶的性质未知， 故使用能分离酶且不损伤酶活性的盐析法。 盐析法：中性盐能破坏蛋白分子的表面电荷使蛋白质 聚沉析出。 透析法：析出蛋白质因含有大量盐离子影响纯化，故 有半透膜透析，离子可以离开半透膜，而蛋白质分子 不可以。
3.2目标酶的初步提取： 3.2.1 提取液配置：饱和硫酸铵溶液调节PH值至6.2，
5.生物大分子提取方法 5.1.核酸的分离纯化
5.1.1分离纯化原则：
（1） 保持核酸分子一级结构的完整性
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级 结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合 的方式。 具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力。 （2） 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素； 复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物
5.1.2
分离纯化的步骤： (1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质， 蛋白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。 (2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的 溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些 盐离子与杂质。 (3)测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法 测定核酸的含量。 (4)保存：目标核酸的保存处理
3.课题技术路线
（二）从肝组织中提取一种酶 2.1.生物样品的选择 2.2生物样品处理 2.3.具体检测方法 2.4.数据处理 2.5.质量控制方法
1.生物样品的选择：健康2月龄 wistar大鼠
原理：由于肝脏内酶常和脂类或者糖结合，故应将实
验动物饥饿24h处理。保证肝内酶的活性和减少不必 要杂质。
1.课题研究背景
生物大分子是指生物体内广泛的活性物质，分子量上千上
万甚至更大，多数生物大分子为多聚体。由简单有机化合 物聚合而成。 20世纪以来，生物化学、分子生物学和细胞生物学生物迅 猛发展，实验室里生物大分子的合成进步速度可观。大分 子的分离纯化与鉴定一直以来是生物化学研究的基础，是 生物化学工作者的重要基本功。生物大分子广泛存在于机 体的各类组织中，以蛋白质、核酸、脂质、多糖为主。诸 多生物大分子合成分离和纯化已经从实验室走向工厂化， 因此生物大分子的相关技术尤为重要。
概述
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
2.课题研究内容
1.从生物样品中分离纯化生物
大分子 2.利用分离纯化生物大分子方 法从肝组织中提取分离鉴定一 种酶（该酶含三个大小不同亚 基，pI=6.2。）
创新点
对该酶的特性结果及分子量不
5.质量控制方法： 5.1控制样品分析 5.2 比对
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
4.仪器和试剂
试剂：PBS溶液、1%-2%链霉素硫酸盐、苯甲基磺酰氟、
饱和硫酸铵溶液、氨水、硫酸、乙酸、蔗糖、磺基水 杨酸、DEAE-纤维素、30%PEAG，1.5mol/L TrisHCl(PH8.8),1.9mol/L Tris-HCl(PH6.8) ，5X电泳缓 冲液、100g/L过硫酸铵溶液，四甲基乙二胺，0.25% 考马斯亮蓝，脱色液。 仪器：试管、超速离心机、常速离心机、透析袋、电 磁搅拌器、蠕动泵、玻璃层吸柱、滴管、玻璃板、电 泳仪，垂直板电泳槽，烧杯，移液枪，刀片，回形针， 塑料盒，刮板，刻度尺。
3.3目标酶的分离纯化： (1)取DEAE-纤维素，调节PH至6.3，进
行装柱平衡，用乙酸铵进行第一次洗 脱。同时用磺基水杨酸进行检测，收 集第二个峰的组分。 (2)回收DEAE-纤维素，调节PH至6.1， 再次装柱平衡,上(1)取得样品，洗脱， 收集第一个峰的组分。
3.4 目标酶的鉴定：取目标酶提取液，进行SDS-PAGE
2.3去除核酸： 原理：细胞内含有大量核酸，会影响实验结果。除核 酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试 验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶 菌酶等。这里选用链霉素硫酸盐。
2.3去除核酸：1%-2%链霉素硫
酸盐，沉淀去除核酸。
3.1匀浆液的分离： 原理：目标酶位置未知，假设存在
5.3糖的分离纯化 5.3.1 单双糖的分离：常见的单、双糖一般采用合成
的方式。制备如下：脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→ 脱色 →浓缩 →冷却 →结晶（→进一步纯化）。 5.3.2 多糖的分离纯化：
脱脂：由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。 提取：热水浸提法，微波辅助提取法，超声辅助法，索氏提
完成。 5.4.2粗分级：选用一套适当方法，把蛋白质混合物提取 液中，所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。 5.4.3细分级：样品进一步提纯 5.4.4进一步分离优化：将蛋白精细分离开来。常用有沉 淀，离心。电泳。层析。 5.4.5 浓缩：常用减压蒸馏法，空气流动蒸发蒸馏法，冰 冻法，吸收法，超滤法提纯。 5.4.6 干燥与保存：保证蛋白质活性下将其干燥保存。
明确，无法利用分子量差异分 离，但可以利用其等电点完成 分离。鉴定过程中利用SDSPAGE电泳技术可以鉴定亚基情 况是否是符合要求。
概述
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4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
3.课题技术路线
(一）从生物样品中分离纯化生物大
于基质、线粒体、酶体三个位置， 利用差速离心法分离取不同亚细胞 组分。
3.1匀浆液的分离： 3.1.1组分的分离：取匀浆液1.5ml在4℃下
12000r/min 离心15min，EP管内液面分三层，分别取 中、下层。 3.1.2亚细胞组分的分离： (1)离心管加0.5ml 0.34mol/L 蔗糖，下层液体0.5ml 轻轻覆盖在上面，1600r/min离心10min,得到上清①。 (2)沉淀加1ml 0.25mol/L 蔗糖混匀，3500r/min 离 心 10min ，得到上清② (3)上清①②混合为线粒体及酶体悬浮液。 3.1.2 亚细胞组分处理：用超声破碎仪破碎处理线粒 体及酶体悬浮液。
将酶溶液与提取液混匀。 3.2.2 酶的提取：将混合液于离心机3000r/min 离心 10min，取沉淀物加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析 袋透析至不再有离子析出。
3.3目标酶的分离纯化： 原理：DEAE-纤维素为二乙氨乙基纤维素，是阴离子交换 剂。 其原理基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带 有电荷的树脂或纤维素组成。 由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下， 其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱 液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。 结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质 结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加 洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
报告人：王瀚辉 陈聪 王楠 赵一亮 指导教师：赵慧珊 时间：2014.12
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
分子方法 1.提取对象选择 2.制定提取方案 3.文献查阅和前期预备性实验 4.生物材料处理 5.生物大分子提取方法
1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类，
和目标分子的位置。 2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离 高纯度目标分子的方法。 3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料 掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离 途径、
2．生物样品处理： 2.1大鼠饥饿24h后处死，分离肝脏组织，切碎，匀浆
处理，用32层纱布过滤得到匀浆液。 2.2蛋白酶活性抑制：用苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制 蛋白酶活性，防止目标酶水解。 原理：细胞内蛋白酶活性较强，PMSF可和蛋白酶结合 不破坏蛋白酶结构，防止细胞内蛋白质水解
取法，醇提法，其它方法（如稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、 酶法等） 除杂：去除混有的蛋白质细胞色素等。 纯化：分部沉淀法，盐析法，季铵盐沉淀法，柱层析，制备 性区域电泳，膜分离法，金属络合物法，其它方法（如超过 滤法、活性炭柱色谱、LKB柱色谱系统等）
5.4蛋白质的分离纯化 5.4.1 前处理：破坏生物样品组织，保证蛋白质不失活下
4.2物理法： 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，
然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由 于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶 胀破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一 个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可 用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷 却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
电泳检测。 (1)样品煮沸10-15min (2)制电泳胶 (3)上样 (4)电泳 (5)0.25%考马斯亮蓝R250染色10-15min (6)脱色处理 (7)若出现三个条带则确定为目标酶，若无则取线粒 体和酶体提取液，如重复3过程。