从生物样品中分离纯化生物大分子

分子方法 1.提取对象选择 2.制定提取方案 3.文献查阅和前期预备性实验 4.生物材料处理 5.生物大分子提取方法
1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类，
和目标分子的位置。 2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离 高纯度目标分子的方法。 3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料 掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离 途径、
3.课题技术路线
（二）从肝组织中提取一种酶 2.1.生物样品的选择 2.2生物样品处理 2.3.具体检测方法 2.4.数据处理 2.5.质量控制方法
1.生物样品的选择：健康2月龄 wistar大鼠
原理：由于肝脏内酶常和脂类或者糖结合，故应将实
验动物饥饿24h处理。保证肝内酶的活性和减少不必 要杂质。
3.3目标酶的分离纯化： (1)取DEAE-纤维素，调节PH至6.3，进
行装柱平衡，用乙酸铵进行第一次洗 脱。同时用磺基水杨酸进行检测，收 集第二个峰的组分。 (2)回收DEAE-纤维素，调节PH至6.1， 再次装柱平衡,上(1)取得样品，洗脱， 收集第一个峰的组分。
3.4 目标酶的鉴定：取目标酶提取液，进行SDS-PAGE
1.课题研究背景
生物大分子是指生物体内广泛的活性物质，分子量上千上
万甚至更大，多数生物大分子为多聚体。由简单有机化合 物聚合而成。 20世纪以来，生物化学、分子生物学和细胞生物学生物迅 猛发展，实验室里生物大分子的合成进步速度可观。大分 子的分离纯化与鉴定一直以来是生物化学研究的基础，是 生物化学工作者的重要基本功。生物大分子广泛存在于机 体的各类组织中，以蛋白质、核酸、脂质、多糖为主。诸 多生物大分子合成分离和纯化已经从实验室走向工厂化， 因此生物大分子的相关技术尤为重要。
将酶溶液与提取液混匀。 3.2.2 酶的提取：将混合液于离心机3000r/min 离心 10min，取沉淀物加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析 袋透析至不再有离子析出。
3.3目标酶的分离纯化： 原理：DEAE-纤维素为二乙氨乙基纤维素，是阴离子交换 剂。 其原理基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带 有电荷的树脂或纤维素组成。 由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下， 其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱 液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。 结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质 结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加 洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
报告人：王瀚辉 陈聪 王楠 赵一亮 指导教师：赵慧珊 时间：2014.12
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.Leabharlann Baidu器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
3.2目标酶的初步提取：
原理：提取酶的方法有多种，但因为酶的性质未知， 故使用能分离酶且不损伤酶活性的盐析法。 盐析法：中性盐能破坏蛋白分子的表面电荷使蛋白质 聚沉析出。 透析法：析出蛋白质因含有大量盐离子影响纯化，故 有半透膜透析，离子可以离开半透膜，而蛋白质分子 不可以。
3.2目标酶的初步提取： 3.2.1 提取液配置：饱和硫酸铵溶液调节PH值至6.2，
取法，醇提法，其它方法（如稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、 酶法等） 除杂：去除混有的蛋白质细胞色素等。 纯化：分部沉淀法，盐析法，季铵盐沉淀法，柱层析，制备 性区域电泳，膜分离法，金属络合物法，其它方法（如超过 滤法、活性炭柱色谱、LKB柱色谱系统等）
5.4蛋白质的分离纯化 5.4.1 前处理：破坏生物样品组织，保证蛋白质不失活下
4.3化学与生物化学方法： 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的 pH和适当的温度下，
细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的 作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀 盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细 胞膜胀破释放出细胞内含物。 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁 分解。 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶 解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
5.3糖的分离纯化 5.3.1 单双糖的分离：常见的单、双糖一般采用合成
的方式。制备如下：脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→ 脱色 →浓缩 →冷却 →结晶（→进一步纯化）。 5.3.2 多糖的分离纯化：
脱脂：由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。 提取：热水浸提法，微波辅助提取法，超声辅助法，索氏提
5.1.2



分离纯化的步骤： (1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质， 蛋白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。 (2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的 溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些 盐离子与杂质。 (3)测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法 测定核酸的含量。 (4)保存：目标核酸的保存处理
完成。 5.4.2粗分级：选用一套适当方法，把蛋白质混合物提取 液中，所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。 5.4.3细分级：样品进一步提纯 5.4.4进一步分离优化：将蛋白精细分离开来。常用有沉 淀，离心。电泳。层析。 5.4.5 浓缩：常用减压蒸馏法，空气流动蒸发蒸馏法，冰 冻法，吸收法，超滤法提纯。 5.4.6 干燥与保存：保证蛋白质活性下将其干燥保存。
4.2物理法： 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，
然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由 于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶 胀破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一 个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可 用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷 却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
5.2脂质的分离纯化
(1)先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织按1：20的量和



氯仿/甲醇一起组织均浆，分层后在室温下在摇床中摇动 15-20分钟。 (2) 均浆通过滤纸过滤或者离心获得液体。 (3) 在离心获得的液体中加入0.2倍体积的水或者0.9%的 生理盐水，涡旋几秒钟混均，然后2000rpm离心得到两相 溶液，如果需要的话用甲醇/水（1/1）的将两相界面洗一 到两次，洗的过程不要让甲醇/水与下层混合。 (4) 通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相含有脂质， 如果体积在2-3ml以下则通过真空旋转蒸发器或在氮气下 浓缩。 (5) 二氯甲烷可以替代氯仿，结果表明二氯甲烷/甲醇能 够取代氯仿/甲醇，因此能够避免氯仿带来的健康、安全 和管理问题。
电泳检测。 (1)样品煮沸10-15min (2)制电泳胶 (3)上样 (4)电泳 (5)0.25%考马斯亮蓝R250染色10-15min (6)脱色处理 (7)若出现三个条带则确定为目标酶，若无则取线粒 体和酶体提取液，如重复3过程。
4.数据处理：根据MARKER计算蛋白质相对分
子质量。 由于蛋白质为三个亚基组成，三个亚基质量 和即为蛋白质质量。SDS-PAGE电泳分别得到 三个亚基质量，即可得到蛋白质分子量。
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
2.课题研究内容
1.从生物样品中分离纯化生物
大分子 2.利用分离纯化生物大分子方 法从肝组织中提取分离鉴定一 种酶（该酶含三个大小不同亚 基，pI=6.2。）
创新点
对该酶的特性结果及分子量不
于基质、线粒体、酶体三个位置， 利用差速离心法分离取不同亚细胞 组分。
3.1匀浆液的分离： 3.1.1组分的分离：取匀浆液1.5ml在4℃下


12000r/min 离心15min，EP管内液面分三层，分别取 中、下层。 3.1.2亚细胞组分的分离： (1)离心管加0.5ml 0.34mol/L 蔗糖，下层液体0.5ml 轻轻覆盖在上面，1600r/min离心10min,得到上清①。 (2)沉淀加1ml 0.25mol/L 蔗糖混匀，3500r/min 离 心 10min ，得到上清② (3)上清①②混合为线粒体及酶体悬浮液。 3.1.2 亚细胞组分处理：用超声破碎仪破碎处理线粒 体及酶体悬浮液。
5.生物大分子提取方法 5.1.核酸的分离纯化
5.1.1分离纯化原则：
（1） 保持核酸分子一级结构的完整性


意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级 结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合 的方式。 具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力。 （2） 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素； 复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物
5.质量控制方法： 5.1控制样品分析 5.2 比对
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
4.仪器和试剂
试剂：PBS溶液、1%-2%链霉素硫酸盐、苯甲基磺酰氟、
饱和硫酸铵溶液、氨水、硫酸、乙酸、蔗糖、磺基水 杨酸、DEAE-纤维素、30%PEAG，1.5mol/L TrisHCl(PH8.8),1.9mol/L Tris-HCl(PH6.8) ，5X电泳缓 冲液、100g/L过硫酸铵溶液，四甲基乙二胺，0.25% 考马斯亮蓝，脱色液。 仪器：试管、超速离心机、常速离心机、透析袋、电 磁搅拌器、蠕动泵、玻璃层吸柱、滴管、玻璃板、电 泳仪，垂直板电泳槽，烧杯，移液枪，刀片，回形针， 塑料盒，刮板，刻度尺。
2．生物样品处理： 2.1大鼠饥饿24h后处死，分离肝脏组织，切碎，匀浆
处理，用32层纱布过滤得到匀浆液。 2.2蛋白酶活性抑制：用苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制 蛋白酶活性，防止目标酶水解。 原理：细胞内蛋白酶活性较强，PMSF可和蛋白酶结合 不破坏蛋白酶结构，防止细胞内蛋白质水解
明确，无法利用分子量差异分 离，但可以利用其等电点完成 分离。鉴定过程中利用SDSPAGE电泳技术可以鉴定亚基情 况是否是符合要求。
概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线
4.仪器及试剂
5.前期研究基础或预实验结果
3.课题技术路线
(一）从生物样品中分离纯化生物大
2.3去除核酸： 原理：细胞内含有大量核酸，会影响实验结果。除核 酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试 验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶 菌酶等。这里选用链霉素硫酸盐。
2.3去除核酸：1%-2%链霉素硫
酸盐，沉淀去除核酸。
3.1匀浆液的分离： 原理：目标酶位置未知，假设存在
4.生物材料的处理：生物大分子来源通常为生物组织
或微生物菌落，首先需要破碎组织。 4.1机械法： 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中， 加入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法， 通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用 10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高 速分散器)将组织的细胞打碎。(植物微生物）