海洋细菌的分离与培养5

海洋细菌的分离与培养制药工程王凯指导教师曲田丽摘要：本文自青岛城阳区海西村海域距离海岸50m处采集海泥和海水样品，采用平板稀释分离方法进行海洋细菌分离，共分离出4种海洋细菌分别为X1、X2、X3、X4。

再以6种病原细菌，6种病原真菌为供试靶标菌进行生物活性测定，结果表明，所分离的海洋细菌X4对番茄早抑病菌抑菌效果最好，最高抑菌率达84.7%。

关键词:海洋细菌；分离；培养；活性测定Isolation and Cultivation the Marine BacteriaPharmaceutical engineering Wang kaiTutor Qu TianliAbstract:The mud and sea water of this experiment was come from the city of Haixi Village of Chengyang Qingdao sea，where away off the coast 50m, then use separation-plate -dilution methodand flat culture isolated four species of bacteria. Then use six bacteria, six fungi as the bacteria tested target for bacteria bioassay. At last the marine bacteria had best effect on Alternaria solani,the inhibitory rate was 84.7%.Key word: Marine bacterium; Separation; Raise; Active determination1 引言1.1农药的研究现状20世纪，人工合成的化学物质已遍及人类生活的各个角落，化学合成药剂成为药物的主流，合成药剂的出现，天然产物药剂被冷落了很多年，但实践证明，化学合成作为发现新药的工具目前存在这很大的局限性，如在新药的研发中筛选物质比较盲目、能源消耗大、药剂毒性大、作用单一、抗菌谱窄以及残留量大和造成环境污染等问题，它们虽然对人类的生活和健康做出了巨大的贡献，但也让人类为此付出了沉重的代价。

与此同时，近年来制药工业新药产出率持续低落。

随着人们对生态农业和环境意识的提高，化学防治的种种弊端已越来越引起人们的关注，同时随着人类发展观－可持续发展以人为本，消费观－注重提高生活质量，医疗保健观-整体上提高自身免疫力的发展变化，特别是伴随绿色革命－回归自然的时代到来，人们对药剂的选择有了重大转变，并已开始认识到充分利用天然物质是最佳选择。

天然产物在新药发现中占有非常重要的地位。

我国农业部农药检定所颁布的《农药登记资料要求》中与生物防治有关的农药种类包括：（1）生物化学农药:主要包括信息素、激素、天然植物生长调节剂和昆虫生长调节剂、酶等；（2）微生物农药:自然界存在的用于防治病、虫、草、鼠害的真菌、细菌、病毒和原生动物或被遗传修饰的微生物制剂；（3）转基因生物农药:指防治《农药管理条例》中所述的有害生物或调节植物抗逆性、抗除草剂的利用外源基因工程技术改变基因组构成的农业生物。

其登记有特殊要求；（4）天敌生物农药:指商品化的除微生物农药以外具有防治《农药管理条例》中所述的有害生物的生物活体。

其中微生物农药是目前发展最为迅速的生物农药之一，在农业生产中得到日趋广泛的重视和推广应用[1]。

1.2海洋微生物在农药中的应用1.2.1海洋微生物的研究进展浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，海洋生物有49个门类，至少16万种以上。

海洋生物资源的最大特点在于它能够通过生物个体的繁殖、发育、生长和新老交替，使资源得到更新、补充，具有一定的自我调节能力。

因而有人称它为“再生性资源”或“可补性资源”。

海洋的面积占地球面积的71%。

海洋独特的自然条件:高压、低营养、无光照、局部高温、高盐等,使得海洋微生物具有特殊的代谢途径和遗传背景,从而具有产生特殊结构和功能活性物质的能力[2]。

据研究发现,约27 %的海洋微生物都能产生抗菌活性物质;从海洋真菌分离出的次级代谢产物70 %～80 %具有生物活性。

许多海洋微生物能产生新结构的活性物质。

Koyama 等从一株未鉴定的海洋真菌中得到一种新的二萜: Phomactin H；Robert等从海洋来源的真菌Aspergilla us carneus 的代谢产物中分离到7种活性化合物,其中5种是新化合物(aspergillicins A-E)[3]。

目前,在海洋微生物及其代谢产物中发现了许多特异、新颖、结构多样、陆地微生物很少产生的活性物质,有些物质的结构类型在陆生生物中从未发现过,因此海洋微生物成为又一个具有巨大开发潜力的天然药物宝库。

海洋微生物有产生生物活性物质的巨大潜力，目前已从海洋微生物(包括海洋细菌、海洋细菌和海洋放线菌)中分离到许多海洋生物活性物质，这些物质化学结构丰富多样，许多分子结构新颖独特，是陆地生物所不具有的。

因此，人们对从海洋环境中极其多样性的微生物中开发到新的特效药寄予极大的希望。

对海洋细菌的分离与培养研究，能发现几种具有生物性的农药先导化合物，为后期的农药新品种的研发奠定基础[4]。

海洋生物目前还属于一块新开发的领域，是未来人类获取药物的一个重要来源，海洋细菌作为一个重要分支，其发展潜力巨大。

浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，目前的研究表明，海洋微生物不仅在海洋生态环境和物质循环中具有及其重要的作用，也是各种新型生物活性物质的潜在来源。

海洋微生物的开发，极其关键的一步就是将特定环境里的资源菌株分离出来。

1.2.2进行海洋微生物分离培养研究的意义微生物对抗生素的耐药性是治疗人类细菌性疾病的一大难题。

寻找更为有效的抗生素成为各国研究者的研究热点。

目前，海洋以其独特的生境条件成为新抗生素的重要来源。

国外在上世纪四十年代就开始了对海洋微生物抗菌活性物质的研究，50年前从海洋生物中发现并成功研制了第一个新抗生素—头抱菌素，开创了开发海洋新抗生素的先河。

近几年，由于海洋生物技术的发展，从海洋生物中提取的抗感染活性物质更是层出不穷。

日本学者发现约27%种属的海洋微生物具有产抗菌活性物质的能力；还检测了海洋微生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母等8种细菌和真菌的抑菌作用，结果发现，海洋中14.1%的细菌、44.0%的防线菌，0.5%的真菌具有不同的抑制作用[5]。

研究海洋微生物的培养与分离不仅可以为人类提供更多更好的物质来源，还可以为人类的医药事业作贡献。

现代化生物技术在海洋微生物多样性研究中的应用，克服了传统分离培养方法的限制。

同时，也应看到，现代生物技术不仅所需费用较高，而且方法本身还存有不足，已有研究表明，纯培养条件下得到的微生物的测序结果与直接对样品检测的结果相差很大。

因此，在对利用现代生物技术所取得的结果进行理论探讨时，应该时刻考虑到方法的代表性和稳定性。

同时，还应对传统的微生物分离培养得到的结果，做出了合理的判断和解释，只有这样，才能寻找更好的分离培养的方法。

近来，我们发现海洋微生物的资源的开发与利用更有助于医药、农药的发展。

资源比陆生生物丰富的多，投资发展海洋微生物科技,可能会产生新的化合物,对药物开发具有重要意义。

陆源天然产物一直以来是人类丰富的药物资源，但随着对陆地资源的深入研究，从中发现新的药物先导化合物已变的越来越困难，而传染性病菌对传统抗生素的抗药性正在迅速发展，特别是新病原菌和新病毒不断出现，因此人们逐渐把注意力转向一个尚未开发的巨大天然资源宝库—海洋，特别是对从海洋微生物中找到新的特效药物寄予极大的希望。

1.3 海洋细菌在农药中的开发和应用目前，已知的大多数生理活性化合物的产生是菌株特异的，故可直接培养分离到的菌株以取得新生理活性化合物。

对新药的开发而言，从海洋细菌中筛选具有活性的菌株是一项重要的前期工作，而对海洋细菌的分离培养就是前期工作的关键。

由海洋细菌代谢物提取的农药，抗菌谱广、毒性低，有极好的防治效果，是一种无公害的农药，具有很大的发展前景。

海洋细菌及其代谢产物中寻找控制病原菌的生物农药成为新农药研究的一个重要方向。

在农药开发研究方面国外科学家取得了不少进展如Capon等从澳大利亚维多利亚西南海岸附近海滩采集到的样本中分离到海洋放线菌MST-MAl90，从其培养液中分离到2个新的芳香酰胺lorneamidesA-B，表现出杀真菌和杀线虫的活性。

同时我国的林永成和周世宁研究组从南海海泥中筛选出拟诺卡菌属的No.110并分离出5种环二肽，具有明显的抑菌能力[6]。

2002年由中国科学院沈阳应用生态所和华北制药集团爱诺有限公司联合开发成为生物农药—宁康霉素。

经室内抑菌试验，结果表明，宁康霉素对供试植物病原菌玉米纹枯病菌、苹果轮纹病菌和灰霉病菌等抑菌效果十分显著，田间试验对番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、葡萄灰霉病、苹果轮纹病、梨黑星病、葡萄毛毡病和棉花黄萎病等作物病害生物防治效果突出。

宁康霉素是纯微生物制剂，与化学农药相比，具有无毒高效的优点，属于对环境友好型的绿色新型生物农药，在生态农业中具有广阔的应用前景[7]。

张海龙等采用稻瘟霉活性筛选体系进行菌种筛选，发现海洋细菌Alter nalia sp. 的发酵液对稻瘟霉分生孢子有很强的抑制和诱导变形作用。

对该菌株发酵液中的代谢产物进行活性追踪分离，得到了6个化合物。

近来，越来越多的研究表明许多具有开发前景的海洋生物活性物质并不是由海绵、海藻等动植物自身产生的，而是由与其共生或者腐生的微生物产生的。

海洋细菌作为海洋微生物的一个重要组成部分，其代谢产物的多样性正日益受到重视。

如从海洋链霉菌—鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种的代谢产物中，不仅发现了新抗生素8510，而且也发现了肌醇胺霉素和春日霉素，过去它们都是由陆栖微生物产生的。

其中春日霉素是一种重要的农用抗生素，抗菌谱广、毒性低，对稻瘟病等有极好的防治效果，是一种无公害的农药[8]。

1.4 海洋细菌的分离与培养目前国内外对来自沿岸、近海区域的样品，最常用的细菌分离方法是将样品采用无菌海水进行一系列的稀释，在吸取一定量某几档稀释度的均液涂布于培养基上分离培养；对远海、深海的样品，特别是深海中，由于异样细菌密度较小，在培养前需将样品中的微生物浓缩到超滤膜上，再将超滤膜进行分离培养[9]。

早期一直认为海洋细菌难以培养和分离鉴别，对其活性物质的研究难有作为，进步缓慢。

近来，海洋细菌研究技术取得重大的，有些是突破性的进展。

主要有两方面：一是培养技术，例如发现采用稀释培养法能使人们得以分离获得海水中大量存在的寡营养细菌，极大的丰富了人们对海洋浮游细菌的认识。