免疫荧光(IF)实验操作步骤及详细说明
细胞-免疫荧光(IF)简易操作
免疫荧光（IF）简易操作-细胞
1.细胞爬片准备
（1）盖玻片灭菌，放到24孔板中，多聚赖氨酸溶液(Poly-L-Lysine Solution)处理，37℃30min；
（2）吸弃Poly-L-Lysine ，PBS洗两次；
（3）铺细胞，培养24h；
2.固定
（1）预固定：不去培养基，加少许4% PFA到24孔板中，预固定5min；
（2）吸弃液体，轻加PBS洗cell，2次；
（3）加适量4% PFA于24孔板，常温固定cell，10~15min；
（4）吸弃4% PFA，再用1×PBS洗cell一次；
3.通透
加PBS-T(0.5%的Triton X-100)透化，5min；
4.封闭
封闭液（3%FBS+3%羊血清/驴血清in PBS，血清选择取决于抗体来源）室温封闭30-40min；
5.一抗
用封闭液稀释抗体，1:500稀释（视抗体情况而定），湿盒中常温孵育1h；或4℃过夜；
6.二抗
（1）洗一抗，用PBST（1LPBS加500μl Tween-20）浸洗，5min，三次；
（2）二抗，PBS稀释荧光标记二抗；室温1-1.5h；
7.封片
（1）洗二抗，PBST，5min，三次；
（2）H oechst染核，室温10min；
（3）75%甘油封片，指甲油固定玻片。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
免疫荧光IF操作规程
免疫荧光（IF）染色操作规程仪器设备1 18cm不锈钢高压锅和电炉2 医用微波炉3 水浴箱4 冰箱5 湿盒6 耐高温塑料切片架7 可调微量移液器8 定时器9 pH计试剂1 PBS(磷酸盐缓冲液pH7.2-7.4)2 柠檬酸盐缓冲液CBpH6.00.01mol/L1000ml配制柠檬酸三钠3g柠檬酸0.4g3 固定液配方：无水乙醇：氯仿：冰醋酸（6：3：1）组织处理程序1）组织进上述固定液12h后进组织处理程序→75%乙醇1小时→95%乙醇1小时→95%乙醇1小时→无水乙醇1小时→无水乙醇1小时→正丁醇30分钟→二甲苯30分钟→二甲苯30分钟石蜡1小时→石蜡1小时→石蜡1小时→包埋组织IF染色2）切片厚度5um，60度烤片2h，切片脱蜡，水化，依次为二甲笨Ⅰ→二甲苯Ⅱ→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→85%乙醇→75%乙醇各5M；3）1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.2）洗涤切片3×5M；4）组织抗原修复，先将切片专用耐高温高压切片架放好，然后放入柠檬酸盐液中（抗原修复液，0.01mol M，pH6.0），将高压锅封好放至普通电炉上加热，从开始加热至压力锅喷气约要15分钟，在普通高压锅嘴喷气后开始记时，时间1~2 M；5）取出抗原修复盒，待修复液自然冷却，此过程约20 M；6）PBS洗2～3次各5min（1×PBS缓冲液，0.01 M，pH7.2）；7）PBS洗2～3次各5min；8）滴加正常山羊血清封闭液,室温20min。
甩去多余液体。
9）滴加Ⅰ抗50μL（ KLK1 1：100，Bradykinin B2R 1：100）4℃过夜。
10）PBS洗3次各5min；11）滴加FITC标记的Ⅱ抗（ Rabbit ant Goat IgG/FITC, Goat anti Rabbit IgG/FITC）50μL，37℃ 40分钟；12) PBS洗3次各5min；13）荧光显微镜下观察、拍照。
免疫荧光技术试验流程
免疫荧光技术试验流程免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
免疫细胞荧光试验流程：1、细胞爬片制备1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中2）、细胞生长实现60％后取出盖玻片3）、用PBS清洗盖玻片3次4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖上盖子以防止蒸发）5）、用PBS清洗盖玻片3次6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）7）、干燥8—10小时，放入—20°C保管8）、试验前解冻爬片，在室温下用中性PBS浸泡10—15分钟注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。
在这种情况下，可以试验红色或红外的荧光素。
2、破膜1）、0.1％Triton孵育10min2）、PBS洗涤3次，每次3分钟3、抗原修复1）、用滤纸擦干细胞爬片2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液3）、在室温下孵育10分钟4）、用PBS洗涤3次，每次10分钟4、封闭1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）2）、37°C孵育30分钟3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）5、一抗孵育1）、用抗体稀释液稀释一抗，实现抗体制造商介绍的浓度2）、将稀释的抗体（介绍浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育过夜3）、用PBS洗涤3次，每次15分钟6、二抗孵育1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗2）、将稀释的抗体加到爬片上，37°C孵育30分钟3）、用PBS洗涤3次，每次8分钟7、染色1）、爬片上滴加稀释好的SABC—FITC或SABC—Cy3试剂2）、37°C孵育30分钟（避光）3）、用PBS洗涤2次4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min5）、用PBS洗涤3次6）、用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下察看结果。
免疫荧光的原理与操作方法
免疫荧光的原理与操作方法
免疫荧光是一种常用的生物学实验技术，其原理是利用特异性抗体与被检测目标结合，并通过荧光标记的二抗或标记的荧光染料来标记抗原或抗体，从而实现对目标物的定量或定位分析。
免疫荧光的操作方法如下：
1. 样品制备：根据需要检测的目标物选择相应的样品，如细胞、组织或酶解物等，然后进行固定和包埋处理，以保持目标物的完整性和稳定性。
2. 抗体处理：将特异性的抗体加入到样品中与目标物结合，通常先经过一定的预处理步骤，如洗涤样品等。
3. 溶液处理：将样品置于含有稀释的荧光标记物（如荧光染料或荧光素等）的缓冲液中，使标记物与样品中的抗原或抗体结合。
4. 洗涤：为去除非特异性结合的无标记物质，需要进行多次洗涤步骤。
洗涤步骤有助于提高免疫荧光实验的特异性和背景噪声的消除。
5. 扫描与图像分析：用荧光显微镜观察标记物质的荧光信号，并通过相应的图像采集与分析软件进行图像记录和荧光信号的定量分析。
需要注意以下几点：
- 对于不透明的组织，需要进行切片和脱水处理，以便抗体和标记物能够渗透到组织中。
- 抗体的选择应根据被检测目标物的性质和特异性来决定。
- 操作过程需注意无菌条件，避免污染样品。
- 实验中的洗涤步骤要彻底，以避免非特异性结合和背景噪声。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
免疫荧光（IF）细胞化学染色方法
免疫荧光（IF）细胞化学染⾊⽅法免疫荧光（IF）细胞化学染⾊⽅法⼀、标本制作 可制作涂⽚、印⽚、细胞单层培养物、组织切⽚，经适当固定或不固定，作免疫荧光染⾊⽤。
⼆、荧光抗体染⾊⽅法 （⼀）直接法 1．染⾊切⽚经固定后，滴加经稀释⾄染⾊效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗⼈γ-球蛋⽩荧光抗体或兔抗⼈IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染⾊30min，切⽚置⼊能保持潮湿的染⾊盒内，防⽌⼲燥。
2．洗⽚ 倾去存留的荧光抗体，将切⽚浸⼊pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再⽤蒸馏⽔洗1min，除去盐结晶。
3．⽤50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）⽢油封固、镜检 4．对照染⾊ ①正常免荧光⾎清染⾊，如上法处理切⽚，结果应为阴性。
②染⾊抑制试验（⼀步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋⽩或⾎清（相同）等量混合，如上法处理切⽚。
结果应为阴性。
为证明此种染⾊抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可⽤盐⽔代替未标记抗⾎清，染⾊结果应为阳性。
此法结果较⼆步法稳定。
③类属抗原染⾊试验，前⾯已作叙述。
直接法⽐较简单，适合做细菌、螺旋体、原⾍、真菌及浓度较⾼的蛋⽩质抗原如肾、⽪肤的检查和研究。
此法每种荧光抗体只能检查⼀种相应的抗原，特异性⾼⽽敏感性较低。
（⼆）间接法 （1）切⽚固定后⽤⽑细滴管吸取经适当稀释的免疫⾎清滴加在其上，置于染⾊盒中保持⼀定的湿度，37℃作⽤30min。
然后⽤0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，⽤吸⽔吸去或吹⼲余留的液体。
（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗⼈γ-球蛋⽩荧光抗体等），同上步骤，染⾊30min，37℃，缓冲盐⽔洗两次10min，搅拌，缓冲⽢油封固，镜检。
对照染⾊：①抗体对照：⽤正常兔⾎清或⼈⾎清代替免疫⾎清，再⽤上法进⾏染⾊，结果应为阴性。
②抗原对照：即类属抗原染⾊，亦应为阴性。
③阳性对照。
间接法中上述⽅法称双层法（Double Layer Method）。
IF步骤
IF/ICC实验步骤基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min。
（3）通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min。
通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4）封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5）一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。
少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的目的有三：①防止细胞从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；③使标本易于保存。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③应保持细胞和亚细胞结构；④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
IF实验步骤
免疫荧光组织化学实验步骤（石蜡切片，SABC法，博士德）第一天：1. 二甲苯Ⅰ脱蜡 20min2. 二甲苯Ⅱ脱蜡 15min3. 二甲苯Ⅲ脱蜡 10min（二甲苯脱蜡时间视温度而定，温度高时间就短，温度低则时间就长）4. 无水乙醇Ⅰ 5min5. 无水乙醇Ⅱ 4min6. 95％酒精 2min7. 90％酒精 1min8. 80％酒精 1min9. 70％酒精 1min10. 石蜡切片过完酒精后，将其浸入蒸馏水中2min。
11.我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用中高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。
到时间后将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。
（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）12. 甩干玻片，用免疫组画笔在组织周围画圈，然后滴加稀释的正常血清封闭，室温30min，以减少非特异性染色。
13. 甩去封闭液，不洗。
每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒，4℃过夜；第二天：14. 37℃复温30min（根据具体情况确定），PBS冲洗3次，每次3min；15. 在玻片上滴加稀释的生物素化二抗，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗去二抗，3min×3次；16. 在玻片上滴加稀释的SABC-FITC(或SABC-CY3)，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗5min×4次；17. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育5min，可对标本进行染核，PBS 3min×4次洗去多余的Hoechst 33342（或DAPI），用滤纸擦去标本外的PBS；（选做）18. 用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察。
免疫荧光操作流程步骤
免疫荧光操作流程步骤下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
IF实验操作步骤详解
IF实验操作步骤详解免疫荧光方法*重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。
A.所需溶液和试剂NOTE: Prepare solutions with Milli-Q or equivalently purified water.注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。
1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠 (NaCl), 2g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
调整pH到7.4。
2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。
开封以后放在4°C避光保存。
使用时用PBS稀释。
3.二甲苯无水乙醇，组织学级，100%和95%。
1.蒸馏水(dH2O)2.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。
边搅拌边加入75µL Triton X-100(100%)。
3.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml 蒸馏水，混匀。
加入0.4 BSA，使溶解。
边搅拌边加入120µL Triton X-100(100%)。
4.10 mM柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)溶解在1L蒸馏水中。
调整pH为6.0。
5.1X PBS, 高盐(0.4M) (高盐PBS)：配置1L时，取100ml 10X PBS兑入900 ml蒸馏水，另加23.38 g NaCl，使溶解。
6.荧光素标记的二抗(推荐的二抗)注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的二抗时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低。
免疫荧光检测
免疫荧光SOP一．总纲（一）技术原理免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）。
基本原理是抗原与抗体特异性结合，具体为带荧光标记的抗体在组织细胞上与抗原特异性结合，在荧光显微镜下，对抗原进行定性、定位和定量检测的技术。
（二）研究进展二．实验操作免疫荧光基本操作流程如下：（一）切片脱蜡水化脱蜡水化的目的是将石蜡包裹住的抗原暴露于与抗体结合的水环境中，便于两者结合。
若脱蜡和水化不全，则易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
1.实验操作如下：（1）烤片：将石蜡切片置于烤箱中烤片60min；（2）脱蜡：入二甲苯5min×3；（3）水合：100%乙醇，5min×2；95%乙醇5min；70%乙醇5min；ddH2O浸洗5min×2。
2.技术要点：（1）注意无水乙醇和二甲苯的新旧程度，若出现雾状，则需及时更换；（2）60℃烘箱烤片时间勿过久（二）抗原修复与封闭液封闭由于固定液和石蜡导致组织蛋白的氨基酸残基在分子内或分子间形成醛基，或发生蛋白交联，导致蛋白质三级结构或四级结构改变，出现空间位阻，从而封闭抗原决定簇，阻碍抗体与抗原的结合。
因此，需要进行抗原修复暴露抗原。
修复方法有很多种，常见的为高温高压修复法。
封闭目的为细胞表面（特别是淋巴造血组织、淋巴细胞、单核细胞等）存在Fc受体，可与抗体（Ig）结合，形成非特异性染色。
主要是与二抗的非特异性结合。
可用5%二抗来源动物种属的正常血清或5%BSA，可避免抗体蛋白吸附于组织切片中高电荷的胶原和结缔组织成分上，用于封闭组织切片的蛋白疏水基团。
1.实验操作如下：抗原修复以高温高压修复为例。
实验材料：柠檬酸盐组织抗原修复液（福州迈新），EDTA高温抗原修复（福州迈新），电压力锅（美的MY-12CH402A）A.柠檬酸盐高压抗原修复：（1）将商品化的柠檬酸盐缓冲液按说明书进行稀释，并调节pH至6.0；（2）将装有抗原修复液的修复盒置于已装有自来水的高压锅中，大火加热至沸腾；（3）将水化后的切片置于修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热中喷气，此时开始计时5min，压力锅断开电源，开气阀开盖；（4）取出修复盒自然冷却至室温。
免疫荧光法步骤
免疫荧光法步骤免疫荧光法（Immunofluorescence Assay，简称IFA）是一种利用免疫学原理和荧光技术相结合的检测方法。
本文将详细介绍免疫荧光法的步骤。
一、样本制备在进行免疫荧光法之前，首先需要准备好待检样本。
样本可以是细胞、组织或体液等。
在准备样本时，需要注意避免样本的污染和损伤。
对于细胞和组织样本，可以通过离心和冻切等方法进行处理，以获得高质量的样本。
二、标记抗体免疫荧光法的核心是使用荧光标记的抗体来检测待检物质。
在进行免疫荧光法之前，需要选择适当的抗体，并将其与荧光染料结合。
常用的荧光染料有荧光素（Fluorescein）和罗丹明（Rhodamine）等。
标记抗体的方法可以是直接标记或间接标记。
直接标记是将荧光染料直接与抗体结合，而间接标记是先与一种荧光标记的二抗结合，再与待检样品中的抗原相互作用。
三、制备荧光显微镜样品载玻片为了在荧光显微镜下观察样品，需要将样品固定在载玻片上。
首先，将载玻片清洗并在其表面涂覆聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）或其他黏附剂，以增加样品的附着性。
然后，将样品滴在载玻片上，用吸管吸掉多余的样品液。
四、免疫反应将制备好的样品载玻片与标记抗体混合，进行免疫反应。
在免疫反应过程中，标记抗体与样品中的抗原发生特异性结合。
这一步骤是免疫荧光法的关键，需要注意反应时间和温度的控制，以确保反应的充分和特异性。
五、洗涤免疫反应结束后，需要对样品进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他杂质。
洗涤的目的是减少背景荧光和非特异性结合的产生。
洗涤可以使用缓冲液（如PBS）或其他洗涤液，反复洗涤多次，直到洗涤液中不再出现明显的荧光信号为止。
六、荧光显微镜观察将洗涤好的样品载玻片放置在荧光显微镜上，通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号。
荧光显微镜可以通过荧光滤光片选择合适的激发波长和发射波长，以增强荧光信号的检测和观察。
七、结果分析根据荧光显微镜观察到的荧光信号，可以对样品进行结果分析。
免疫荧光实验原理及其步骤
免疫荧光实验原理及其步骤免疫荧光实验是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定的抗原或抗体。
其原理是利用荧光染料与抗原或抗体结合形成复合物，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而确定目标物的存在和分布情况。
下面将详细介绍免疫荧光实验的步骤及其原理。
免疫荧光实验的步骤一般分为样品处理、抗体处理、荧光染色和观察四个主要步骤。
第一步是样品处理。
首先需要选择合适的样品，可以是细胞培养物、组织切片或动物体内的器官等。
样品处理的目的是使样品适应实验条件并提取目标物，一般包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定可以采用乙醛或甲醛等化学物质，使细胞或组织保持形态结构。
脱水和透明化则是为了去除样品中的水分，并使其透明以便于观察。
第二步是抗体处理。
根据实验的需要，可以选择针对目标物的一抗或二抗进行处理。
一抗是指对目标物抗原的特异性抗体，二抗是指对一抗特异性结合的抗体。
抗体处理的目的是使抗体与目标物结合形成复合物，一般需要在适当的温度和时间下进行孵育。
在进行抗体处理之前，需要对样品进行预处理，如孵育样品以降低非特异性结合等。
第三步是荧光染色。
荧光染色是利用荧光染料标记抗体，以便于荧光显微镜观察。
常用的荧光染料有荧光素（fluorescein）和罗丹明（rhodamine）等。
荧光染色的原理是荧光染料与抗体结合后发射荧光信号，通过荧光显微镜可以观察到目标物的荧光信号。
荧光染色的过程包括将荧光染料溶液加入样品中，与抗体发生特异性结合，并进行洗涤以去除未结合的荧光染料。
最后一步是观察。
观察是通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标物的存在和分布情况。
观察时需要选择适当的荧光滤光片和荧光显微镜参数，以便于观察到荧光信号的强度和位置。
观察结果可以通过摄影或记录视频等方式保存下来，以便进一步分析和研究。
免疫荧光实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面的蛋白质等。
免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验方法
免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验方法免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：1、细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.3、通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的位置和表达水平的常用技术。
下面我将从步骤和经验总结两个方面来回答你的问题。
免疫荧光实验步骤：
1. 样本制备，首先，收集细胞或组织样本，然后进行固定和切片处理，以确保样本的完整性和稳定性。
2. 抗原修饰，样本经过透化处理后，使用适当的抗原修饰方法，如热处理或酶解，以增强抗体的结合效率。
3. 抗体孵育，将样本与特异性的一抗（一般为多克隆抗体）孵育，使其与目标蛋白结合。
4. 荧光二抗孵育，将荧光标记的二抗孵育，使其与一抗结合形成复合物。
5. 染色与显微镜观察，样本经过洗涤后，使用荧光显微镜观
察，检测目标蛋白在细胞或组织中的分布和表达水平。
免疫荧光实验经验总结：
1. 选择适当的抗体，选择具有高亲和力和特异性的抗体至关重要，可以通过文献综述或试验验证来确定抗体的适用性。
2. 优化实验条件，包括抗原修饰、抗体浓度、孵育时间等实验条件的优化，以确保信号强度和特异性。
3. 合理的阳性和阴性对照，使用已知表达目标蛋白的阳性对照和不表达目标蛋白的阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 注意样本处理，样本处理的温和和一致性对实验结果至关重要，避免因处理不当导致假阳性或假阴性结果。
5. 数据分析和图像获取，在实验结束后，对荧光图像进行合理的获取和分析，避免图像处理过度或不足，确保结果的客观和准确。
以上是免疫荧光实验的步骤和经验总结，希望能够对你有所帮助。
如果还有其他问题，欢迎继续提问。
细胞if实验步骤
细胞IF实验的步骤如下：
细胞爬片：将细胞种植在玻片上，待细胞贴壁后，用PBS清洗玻片三次。
细胞固定：用4%的多聚甲醛固定爬片15分钟，然后用PBS清洗玻片三次。
抗原修复：根据细胞类型，选择适当的抗原修复方法。
对于细胞膜上的抗原，通常不需要抗原修复。
封闭：用第一封闭液（来源于产生二抗的物种的10%血清）孵育细胞30分钟。
一抗孵育：用第一种一抗（溶于1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中）在湿盒中孵育细胞1小时，或4℃过夜孵育。
洗涤：用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
二抗孵育：用第一种二抗（溶于1% BSA 的 PBST 中）避光孵育细胞1小时。
洗涤和复染：用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
然后进行复染，以更好地观察细胞结构。
封片和观察：用适当的封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量避光操作。
以上步骤仅供参考，具体实验步骤可能会因实验需求和细胞类型而有所不同。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可靠性。
免疫荧光IF实验技术服务
免疫荧光IF实验技术服务
【技术原理】
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
【实验流程】
【常见问题】
1、无/弱染色
烤片温度过高，推荐56℃-60℃1-2h；
一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。
2、非特异性背景染色
是否灭活内源性过氧化物酶；
孵育过程中干片；
抗原热修复过度。
3、染色过深
一抗浓度过高；
染色试浓度过高或孵育时间过长；
染色剂浓度过高或孵育时间过长。
【注意事项】
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，荧光可能会淬灭。
2、实验对照设置越多，结果越可信。
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免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明
一、试剂和溶液
10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于100ml PBS 通透液：0.1% triton-100 封闭液：PBS 配制的3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释
二、实验步骤
1.细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12 孔板中，然后
接种细胞，置于37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并
且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细
胞传代2 代后的细胞）；
2.洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；
3.固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适
量PBS；
4.冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）；
5.解冻：常温下放置30 min；
6.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；
7.通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。
（若蛋白为膜表达则无
需此步）
8.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；
9.封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min；
10.一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min；
11.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；
12.二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗，37℃避光孵育50 min；
（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）；
13.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；
14.核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI 室温反应10min （如
果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）；
15.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；
16.细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为
0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min 或4℃孵育过夜；
17.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤2 次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min；
18.封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光
猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上；
19.荧光显微镜观察，记录结果。