第四章 菌种退化和复壮及保藏
2016菌种保藏
菌种的退化、复壮与保藏
（一）、基本概念 1.菌种退化 微生物易变异。变异分为正变和负变。所谓退化，指 的是负变。 菌种退化：指群体中退化的细菌占到一定数量后表现 出的菌种性能下降的现象。 2.菌种复壮 在退化菌种中，用人工方法，使仍保持原有特性的细 胞生长、繁殖，以更新退化的菌株，称为菌种复壮。 方法有纯种分离、紫外线诱变、寄生复壮等。
菌种退化与保藏
菌种退化的原因
• 基因突变引起菌种退化 • 连续移代引起菌种退化 • 环境条件的影响
基因突变引起菌种退化
• 菌体本身的修复机制 • 突变发生在DNAБайду номын сангаас链上,随着复制两股
DNA各自形成子细胞.
连续移代引起菌种退化
• 链霉素生产菌传代退化情况
环境条件的影响
• 基因的表达在一定环境条件下才能完成. • 不同的培养基会影响不同类型细胞的数
方法 根据菌种本身特性和保藏种的用途等 等综合条件选取保藏方法。
量.
如何防止菌种退化
• 尽量少传代 • 菌种纯化 • 采用良好的培养基和培养条件
菌种纯化
• 优良菌种:去处个别低产或不纯细胞. • 已衰退菌种:找出其中还存在的高产菌株.
菌种保藏
目的 保证菌种在一定时间内不死、不衰、 不污染，保持其原有特性。
原理 挑选优良纯菌种，创造适合长期休眠 的环境条件；如低温、干燥、缺氧、避 光等。
微生物工程 - 03微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏
微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏方法一、代谢调控育种Metabolic Control Breeding１.营养缺陷型突变株（auxotroph mutant）•酶缺陷，结果造成中间产物积累；•解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；•渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。
2.抗反馈调节突变株（regulation defective mutant）突变株筛选•调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；•结合，但不发生作用；•结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养缺陷型回复突变株筛选．3.组成型突变株（constitutive mutant）筛选•突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。
•筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。
①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法４.抗（敏感）性突变株（resistant mutant）筛选•包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体①抗生素抗性突变：提高产量②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染③条件抗性突变：如温度，可提高产量④物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。
二、基因重组育种（gene recombination breeding）基因重组育种的定义：是指采用接合、转化、转导、原生质体融合、有性杂交及准性生殖等遗传学方法和技术，使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。
（P24第2段）1.原核生物的基因重组育种（1）接合（conjugation）定义；大肠杆菌的4种不同接合型菌株：F+、F-、Hfr菌株和F’菌株（2）转导（transduction）转导、转导子（transductant）、转导噬菌体（3）转化（transformation）转化、转化子（transformant）、感受态（competence）2.真核微生物的基因重组育种主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。
10菌种的衰退复壮和保藏_PPT课件
菌种保藏的具体方法
2.隔绝空气保藏法： 该法保藏的原理主要是通过限制
氧的供应以削弱微生物的代谢作用， 故不适用于厌氧菌。
石蜡油保藏法 橡皮塞密封保藏法 琼脂柱穿刺封口保藏法
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菌种保藏的具体方法
3.干燥保藏法：断绝对微生物的水分供应，能 使微生物的代谢活动强度明显减弱。
最后，衰退还表现在抗不良环境条件 （抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱 等。
菌种的衰退是一个由量变到质变的逐 步演变过程，必须及时采取有效措施 进行复壮。
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菌种的复壮
1.纯种的分离： 通过纯种分离可把退化菌种中的一部
分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来， 经过扩大培养就可恢复原菌株的典型性状。 粗放的方式：只能达到“菌落纯”的水平， 即从种的水平来说是纯的。 较精细的方式：单细胞或单孢子分离方法。 它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水 平。
菌种的保藏
菌种是国家的重要自然资源，菌 种保藏是微生物学的重要基础工作。 菌种保藏的目的是使之不混乱、不死 亡、不污染，并稳定保持原有特性。 农业微生物学国家重点实验室－－
国内唯一的、代表我国农业微生 物科研领域最高水平的实验室。
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菌种保藏的具体方法
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常见活菌制剂成品的 保存条件及适宜储存时间？
成品种类 冻干乳酸菌 冻干红假单胞菌 液态乳酸菌 液态红假单胞菌 复合芽孢杆菌粉 粪肠球菌
保存条件
密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉
菌种繁育—菌种退化与复壮(食用菌生产技术课件)
长，都能会引起食用菌菌种退化。保藏期间如果斜面母种出现子实体，有菌盖形成的情况下，条件 合适就会有孢子弹射到斜面上萌发出菌丝，有性繁殖和无性繁殖混在一起，食用菌菌种发生退化。
二、防衰措施
一、菌种退化
表现
（1）菌丝体生长缓慢、丛生，长势 稀疏、尖端生长不整齐，整齐度下降 。
（2）对环境条件（氧气、温度、酸 碱度、二氧化碳）、杂菌等的抵抗力 变弱，生活力衰退。
（3）品种变劣，出菇迟，产量降低 ，出菇潮次不明显等。
最终都是产量和质量连续性的下降。
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
外因1：培养环境不适合 温度、湿度、通气、光照、PH值、培养基过于丰富或过于贫瘠等，均可造成菌种失去自我调节的能
力，丧失应该具有的优良种性。 外因2：转代次数过多 实际的食用菌生产中，采用不规范的菌种培养和制作，转代的次数越多，引起食用菌菌种退化的可
菌种退化与复壮
目录
一、菌种退化 二、防衰措施 三、菌种复壮
一、菌种退化
概念
食用菌菌种退化是指在正常栽培条件下，食用菌菌种的优良性状及典型 性由于菌丝体的遗传物质发生变异而在传代过程中逐渐丧失的现象。
菌种退化不是某一次转代突然出现的，也不是短时间发生的。只有群体 中退化菌丝在数量上占一定优势后，才有表现，是从量变到质变的渐变 结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的 最终结果。
医学课件第四部分菌种退化复壮与保藏教学课件
中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院) 中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
1.纯种分离法
平板表面涂布法 菌落纯 （菌种纯） 纯种分离法 平板划线分离法 琼脂培养基浇注法
用“分离小室”进行单细胞分离 细胞纯 （菌株纯）
用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
菌株：又称品系,表示任何由一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁
殖而成的纯种群体及其后代。因此,一种微生物的每一个不同来源的纯培养 物均可称为该菌种的一个菌株。
二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退 的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
广义复壮 在菌种的典型特征或 生产性状尚未衰退前，就 经常有意识地采取纯种分 离和生产性状的测定工作， 以期从中选择到自发的正 突变个体。也称生产育种
种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于
代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
措施 低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中
酶促反应温度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白 添加酸度中和剂
（三）菌种保藏方法
1.斜面保藏法
中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农 业部) 农业部兽药监察研究所(NCIVBP) 中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中 国林业科学院) 中国林业科学院林业研究所(RIF)
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？在食用菌生产中，由于各种原因，常使菌种遗传物质发生变异，进而出现优良性状减退或消失、产量降低、质量下降等现象，这就是菌种退化。
（一）菌种退化：1.菌种退化的实质：菌种退化的实质是遗传物质发生了可遗传的变异。
菌种退化是一个从量变到质变的渐变过程，当发生有害变异的个体在群体中显著增多，以致占据优势时才会表现出来。
对于群体来说，个别细胞的退化变异会随着细胞的分裂而逐步增加，使衰退的个体逐渐增多，最后使整个群体发生严重的衰退。
虽然菌种退化现象普遍存在，但可以采取适当措施延缓其退化进程，将群体的退化控制在最低限度。
尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种退化却需要较长的时间。
因此，在退化的菌种中，经常有少数尚未退化的个体，这是菌种复壮的基础。
2.菌种退化的原因与表现：菌种退化的主要原因是交叉感染、自体杂交、基因突变、培养条件不适等，病毒感染也会引起菌种退化。
食用菌菌种感染病毒后，病毒数量不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且还会通过带毒的孢子传给下一代。
当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中就会表现出产量降低、质量下降等退化现象。
菌种退化除了与其自身的遗传特性和所处的环境密切相关之外，还受转管次数、机械创伤等外界因素影响。
菌种退化的主要表现是理想的优良性状逐渐丧失，继而出现菌丝生长势弱、代谢能力下降、产量降低、易受病虫害感染等。
3.防止菌种衰退的措施：在某种意义上，菌种退化是必然发生的现象，但依然可以采取多种措施防止菌种过早衰退。
（1）控制母种转管次数：从理论上讲，菌种可以进行多次转接；但由于在操作中菌丝受机械创伤等影响，会使菌种产生突变，而多数突变对菌种是不利的。
因此在可能的情况下，尽量减少转管次数。
实践证明，生产上用的菌种转接控制在5代范围内较为合适。
（2）防止菌种混杂在菌种转接、出菇管理等过程中，加强品种隔离管理，减少品种间相互混杂的机会，防止不同品种的孢子四处传播，以保证优良品种的遗传特性相对稳定。
菌种的退化与保藏
• •
• •
• 3.经常进行菌种纯化 • 所谓菌种纯化就是对菌种进行自然分离。首先将菌种 制成单细胞或单孢子悬浮液，经稀释后将其涂布与琼脂平 板上培养，待平板上单菌落培养成熟后挑取单菌落移种斜 面，再经摇瓶 试验后测定其生产能力，从中选出高水平 的菌种。 • 4.采用良好的培养基和培养条件 • 培养基和培养条件可以从多方面影响菌种的性状，因 此，为了防止菌种退化，要选择合适的培养基和培养条件 。 • 5.采用科学的保藏方法 • 在菌种保藏过程中也会发生菌种退化现象，尤其是不 良的保藏条件更易引起菌种退化。因此，要采取科学和有 效的菌种保藏方法以防止菌种优良性状的退化。
• 复壮的方法：
• （1）纯种分离法（pure
稀释分离法 平板划线法 组织分离法
culture isolation）
• （2）通过宿主体复壮
寄生型微生物的退化菌株可接种到相应寄主体内以提高菌株的 活力。
（3）联合复壮
对退化菌株用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍（NT藏
二、菌种的复壮
• 定义 • 狭义的复壮： • 是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产性 能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢 复原菌株固有性状的相应措施。 • • 广义的复壮： • 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取 纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。 • 一种积极的措施 一种消极的措施
• 菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
• 菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
是一项十分重要的基础性工作。
第4章 菌种保藏
抗生素生产工艺
（1）中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC (归口中国科学院) 中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) （2）中国农业微生物菌种保藏中心ACCC (归口中国农业科学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) （3）中国工业微生物菌种保藏中心CICC (归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
抗生素生产工艺
4.真空冷冻干燥法 原理：在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞 结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌 种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变
异和死亡，因而能长期保存，一般为5~10年。
微生物在此条件下易死亡，所以需加入一
些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血
清等。
抗生素生产工艺
四川抗生素研究所(SIA)，四川
华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
抗生素生产工艺
（6）中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC (归口农业部)
农业部兽药监察研究所(NCIVBP)
（7）中国林业微生物菌种保藏中心CFCC (归口中国林业科学院) 中国林业科学院林业研究所(RIF)
抗生素生产工艺
抗生素生产工艺
保藏的菌种如需用时，将安瓿管由液氮中取 出，立即置于38-40℃温水浴中，振荡，直到全 部融化为止，开启移种。
液氮保藏法在实际应用中尚存在一些问题， 如需要经常补充液氮，保藏菌种的管理费用高， 菌种的取出也不如冻干管方便。但这种方法可用 微生物的多种培养材料进行保藏，不论孢子或菌 体、液体培养或固体培养、菌落或斜面均可。此 法是目前最可靠的移种长期保存菌种的方法。
抗生素生产工艺
菌种的复壮措施
(一) 菌种的提纯 (二) 通过寄主体进行复壮
发酵工程-第四章 菌种的复壮与保藏
培养： 将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养 至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～ 37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。 保藏： 培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植 一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉 等，须1～3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外 和污染造成损失。
4）控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利 于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。 另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
安徽医科大学微生物学教研室
第四章：菌种的衰退、复壮与保藏
陈
振
办公室：基础医学院711
E-mail：ottovb@
本章内容
＊一、菌种的衰退和复壮 ＊二、菌种的保藏
第一节
菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指菌种经 过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作 用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
2、宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆 虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 例如： 苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的 虫体内重新分离典型菌株。 根瘤菌属——回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤, 再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至 提高。
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
发酵工程——菌种的衰退、复壮和保藏
国外菌种保藏机构 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）
位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌
4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏 方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状
斜面保藏法
• 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能 淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 • 斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止 培养基脱水并能降低代谢活性。 • 保存期2个月到6个月
穿刺保藏法 • 斜面保藏法的改进 • 常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等 • 1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2 ~3mm的液体 石蜡
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏
高产菌恢复
根据高产菌的特点，选择目的菌落
放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
国内菌种保藏机构 2）林业微生物菌种保藏中心 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物
的菌种保藏，现保藏菌种690余株；
国内菌种保藏机构 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心
菌种保藏与复壮
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3.自然基质保藏法
基质的处理
麦粒浸透、煮熟 麸皮拌湿
装管
灭菌 接种 培养 干燥器去水
特点
防衰老 保藏时间长，1年以上 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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（三）保藏注意
用保种培养基 及时保藏（菌丝长满培养基） 最好换胶塞 用时活化 严防棉塞受潮
学习情景2-4
菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
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一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 ➢目的 不死亡 不生长 不污染
使菌种 不降低或不丧失其优良性
➢原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施。 （一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、
抗逆性差、产量及质量下降。 内因 菌种的遗传物质发生了负变。 根源 外因 传代过多，条件不适宜。
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（二）复壮法
1.繁殖交替法
组织分离
母种
再生 母种
栽培 子实体
孢子分离
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取尖端菌丝
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（三）防衰措施
保证菌种的纯培养 严格控制传代次数 用适宜菌龄的菌种 用适宜培养条件及保藏条件
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冷冻和缺氧
低温
不利 条件
真空
干燥
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（二）常用保藏法 以母种形式保藏
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第一节、菌种退化 一、菌种的退化现象 1· 菌落和细胞形态改变 2· 生产性能的下降 3· 对生长环境的适应能力减弱
米曲霉菌落
单核细胞
二、菌种退化的原因 1· 基因的自发突变 2· 育种后未经很好的分离纯化 3· 培养条件改变 4· 污染杂菌
枯草芽孢杆菌菌落
三、防止退化的措施 1、控制传代次数 2、创造良好的培养条件 3 、采用有效的菌种保藏方 法
五、甘油保藏法
（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在 平皿上划线分离单菌落。 本方法适合于 中、长期菌种 （2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱， 保藏，保藏时 培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm 间一般为2-4 左右。 年左右。 （3）挑取一个单菌落，接种于一个装 50mL 的300mL 30℃或37℃振荡1：1（V/V） （5 ）按 30%三角瓶中 甘油：种子液为 培养10-15小时，至菌密度OD600为 的量加入无菌甘油， 混合后分装至事先灭 1.0-1.5。 （4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液， 菌的菌种保存管（ 1-2mL/ 管）， -70 ℃ 或 涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察 菌体的形态，及是否有杂菌。 液氮保存。
第二节、菌种的复壮 一、纯种分离
二、寄主复壮 三、遗传育种
小菜蛾
小菜蛾幼虫及蛹
第三节、菌种的保藏
美国的菌种保藏中心
菌种保藏冷库
一、斜面冰箱保藏法 方法:将种接在适当的斜面上，经培养长好 后，放在4˚C冰箱中保藏。 保藏时间: 3个月 适用菌种:各种菌种
二· 石蜡油封藏法 方法 : 将无菌石蜡油加入 到菌种上，使菌种与 空气隔绝. 保藏时间: 12个月 适用菌种 取河沙和土，以 4:1 量混合， 装入小试管中，经灭菌后，加入 几滴菌悬液，用接种针搅匀。抽 气干燥，低温保藏。 保藏时间:数年。 适合：细菌的芽孢和霉菌的孢子。
– 四 · 真空冷冻干燥 保藏法
方法 : 在较低的温度下快 速将微生物细胞冻结， 然后使水分升华，使细 胞生命活动处于停止状 态. 保藏期:5年. 适用:各类菌种。