实验十 同工酶分析
同工酶测定
保护酶（SOD、POD、CAT、APX）同工酶分析酶液提取：称取1g样品鲜叶，在冰浴条件下加酶提取液（0.1 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液pH8.0（每100ml内含半胱氨酸0.073g、抗坏血酸0.105g、EDTANa20.075g、甘油10ml、1mol·L-1HCl 5.84ml）2ml，研磨至匀浆，然后在低温冷冻离心机中4℃、13000r·min-1离心20min，上清液极为酶提取液。
电泳（邹琦，2000）：采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行同工酶分析，分离胶浓度POD、CAT为7.5%，SOD、APX为10%，浓缩胶浓度为3%（配方如表1）。
电泳时采用稳流控制，SOD、POD、CAT电泳浓缩胶为15mA/板，分离胶20mA/板；APX电泳浓缩胶、分离胶均为30mA/板，电泳缓冲液中加入2mmol·L-1抗坏血酸，上样前预电10min。
电泳至溴酸蓝标志到达凝胶前沿为止。
酶谱染色：根据酶反应的专一性，采用不同的染色方法，进行同工酶酶谱分析。
SOD同工酶的染色方法：采用四氮唑蓝（NBT）法（胡能书，1985）染色。
电泳完毕后，取下胶片，用无离子水冲洗干净，然后依次浸入下述染色液中：（1）把电泳完毕后的胶片放在A液（2.45mmol·L-1 NBT溶液）中于黑暗下浸20min；（2）在B液（含有28μmol·L-1核黄素、2.8mmol·L-1四甲基乙二胺的36mmol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中于黑暗下浸15min；（3）在C液（含10mmol·L-1 EDTA的0.05mol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中浸泡并于40W日光灯下照光至出现清晰透明的SOD同工酶谱带。
染色后的胶片洗掉浮色后，可保存在7%的醋酸溶液中，供分析、照相、亦可制成干板永久保存。
表1聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板配置方法Table 1 Gel and dyeing solution compounds药剂分离胶10% 分离胶7.5% 浓缩胶3%30%Acr 9.75 ml 7.3 ml 1 ml1%Bis 7.50 ml 5.6 ml 1 ml 分离胶缓冲液 3.75 ml 3.75 ml浓缩胶缓冲液 2.5 ml 蒸馏水8.80 ml 13.15 ml 5.43 mlPOD 同工酶电泳染色：采用联苯胺溶液染色法（邹琦，2000）。
同工酶检测方法
同工酶检测方法
同工酶检测方法是一种用于确定酶活性和酶的存在性的常用实验技术。
同工酶是指具有相似化学结构但在酶活性和功能上有差异的酶。
通过检测同工酶的存在和活性，我们可以了解酶的功能差异和其在生物体内的重要作用。
同工酶检测方法主要包括以下几种：
1. 凝胶电泳法：这是最常用的同工酶检测方法之一。
通过将样品中的酶进行凝胶电泳分离，然后在凝胶上加入适当的底物和染色剂，可以观察到酶的活性带和相应的颜色变化。
根据活性带的位置和颜色变化，可以确定酶的存在和活性差异。
2. 免疫学方法：同工酶也可以通过免疫学方法进行检测。
这种方法利用特异性抗体与酶结合，形成免疫复合物，然后通过染色或荧光标记的抗体检测酶的存在和活性。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，适用于复杂样品的检测。
3. 分子生物学方法：随着分子生物学技术的发展，同工酶的检测也可以通过PCR、测序和基因表达等方法进行。
这些方法可以直接检测目标酶基因的序列差异或转录水平的变化，从而确定不同同工酶的存在和表达差异。
除了以上常用的方法外，还有一些新兴的技术被应用于同工酶的检测，例如质谱分析、表面等离子共振和生物传感器等。
这些方法具有高灵敏度和高通量的特点，可以快速、准确地检测同工酶的存在和活性。
总之，同工酶检测方法在生物学研究和临床诊断中起着重要的作用。
不同的方法可以根据研究目的和样品类型选择使用，从而更好地了解同工酶的功能和生物学意义。
同工酶检测原理
同工酶检测是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定分子的存在和浓度。
其原理基于同工酶的特异性反应。
同工酶是指在酶的催化作用下，对于同一底物具有相同的催化活性，但其结构或电荷可能有所不同的酶。
同工酶的存在是由于基因突变或多态性引起的。
同工酶检测的步骤如下：
1. 提取样品中的酶：首先，从待检测的样品中提取出目标酶。
2. 准备底物：选择适当的底物，该底物在酶的催化下会发生特定的反应。
3. 反应：将提取的酶与底物一起反应，使其发生催化作用。
4. 分离产物：通过某种方法（如电泳）将反应产物分离开来。
5. 可视化：使用某种染色剂或显色剂，将分离的产物可视化。
6. 分析结果：根据产物的分离情况和可视化结果，判断样品中是否存在目标酶，并确定其浓度。
同工酶检测的原理是基于同工酶的特异性反应。
由于同工酶的结构或电荷可能有所不同，因此它们对于特定底物的催化活性也可能有所不同。
通过检测底物的反应产物，可以确定样品中是否存在目标酶，并且可以根据产物的浓度来估计目标酶的浓度。
同工酶实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解同工酶的概念及其在生物体中的生物学意义；2. 掌握同工酶电泳技术的基本原理和方法；3. 通过同工酶电泳实验，观察和分析同工酶在样品中的分布情况。
二、实验原理同工酶是指具有相同催化功能，但氨基酸序列和分子结构不同的酶。
同工酶电泳技术是一种分离和鉴定同工酶的方法，其原理是利用同工酶在电场中的迁移速率差异，将其分离。
三、实验材料1. 实验样品：植物叶片、动物组织等；2. 电泳试剂：琼脂糖、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等；3. 电泳仪器：电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等；4. 其他：移液器、吸管、剪刀、镊子等。
四、实验方法1. 样品制备：将实验样品研磨，加入适量提取液（如Tris-HCl缓冲液），在冰浴中匀浆，离心取上清液；2. 电泳凝胶制备：按照电泳试剂的配方，制备琼脂糖凝胶；3. 电泳样品制备：将提取液加入适量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，混合均匀后，加入适量的样品，制成样品胶；4. 电泳：将制备好的样品胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，进行电泳；5. 成像与分析：电泳结束后，取出凝胶，用凝胶成像系统拍照，分析同工酶的分布情况。
五、实验结果1. 通过电泳实验，观察到样品中存在多种同工酶；2. 不同样品的同工酶分布情况存在差异，说明同工酶在生物体中具有特异性；3. 同工酶的迁移速率与酶的分子量有关，分子量较小的酶迁移速率较快。
六、实验结论1. 同工酶在生物体中具有重要作用，其生物学意义包括催化、调控、信号传递等；2. 同工酶电泳技术是一种有效的分离和鉴定同工酶的方法；3. 本实验成功分离和鉴定了样品中的同工酶，为后续研究提供了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，样品制备和电泳操作应注意无菌操作，以避免污染；2. 电泳条件的选择对同工酶的分离效果有较大影响，应根据实验目的和样品特点进行优化；3. 同工酶的研究有助于揭示生物体的遗传、变异和进化规律。
八、实验总结本实验通过同工酶电泳技术，成功分离和鉴定了样品中的同工酶，验证了同工酶在生物体中的生物学意义。
同工酶测定技术
同工酶测定技术一、电泳测定技术在研究同工酶的方法中，电泳法的使用最广泛。
大致分为显微电泳、自由界面电泳和区带电泳3大类。
以区带电泳最为常用，因其简便、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。
区带电泳法分离的原理与其他蛋白电泳相似。
可选支持物虽多，但目前多用醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
自动化电泳分析系统多采用分辨率较高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采用高压或常压电泳。
电泳后同工酶各组分的检测常用以下方法。
（一）活性显色电泳分离得到的同工酶区带用酶反应染色法进行显色，不能直接显色者可加入工具酶经偶联反应显色。
由于活性显色需依赖其催化活性，因此，电泳后不能进行固定，并且呈色产物要求非水溶性。
常用活性显色系统有：1.重氮试剂染料人工合成的萘酚或萘胺衍生物在酶促反应后产生的萘酚或萘胺，与偶氮染料如固蓝B等生成难溶于水的有色重氮化合物。
如ALP、GGT 同工酶的测定。
2.电子传递染料氧化还原酶类催化反应产生的H+经PMS传递给四唑盐染料，生成不溶性紫红色的甲臜化合物或蓝色的双甲臜。
这类染料适用于氧化还原酶类同工酶检测，如LD同工酶的测定。
3.脱氢酶偶联的指示反应检测波长340nm处NAD （P）H吸光度变化推算同工酶各组分活性，如AST、CK等同工酶测定。
（二）光密度计扫描这是最常用的同工酶质量相对定量方法。
电泳分离同工酶后，经染色、洗脱、固定（滤纸、醋酸纤维素薄膜尚需透明）制成同工酶谱，再用光密度计扫描作相对定量测定。
若显示的区带数与同工酶数不一致时，要考虑巨分子酶的存在。
（三）洗脱法将染色后的各同工酶区带从支持物上切下溶于洗脱剂中，测定各自的吸光度。
以总吸光度为100%，求出各区带百分含量。
若已知总活性，则可求得各同工酶组分活性的绝对值。
二、免疫化学测定技术由于同工酶一级结构不同，因而抗原性也不同，可用特异免疫反应识别。
免疫化学法生物学特异性、灵敏度较高，即使低浓度的酶也能测定，操作简单。
同工酶的鉴定和生物学功能研究
同工酶的鉴定和生物学功能研究同工酶，顾名思义，是指具有相同催化活性但结构不同的酶。
由于同工酶之间结构的差异，它们在功能上可能存在差异，而这种差异也可能与生物体的进化、代谢调节等方面有关。
因此，鉴定和研究同工酶的生物学功能对于理解生物体内的基本生化过程、代谢调节以及疾病的发生发展等具有重要的科学意义。
一、同工酶的鉴定同工酶的鉴定是建立在对酶结构的认识基础上的，它需要通过酶催化活性的测定和酶分子结构的分析来完成。
目前，同工酶的鉴定主要采用以下几种方法：1、电泳法电泳法是一种常用的同工酶鉴定方法，它基于不同的同工酶分子具有不同的电荷、大小和形状的特点来分离同工酶，从而鉴定出同工酶的存在和数量。
这种方法依赖于酶的基本物理化学性质，操作简单，且不需要过多的前期技术准备。
但是，它也存在一些限制，例如测定结果的精度受到影响的因素较多，容易出现假阴性或假阳性等情况。
2、免疫学方法免疫学方法主要是利用抗体的特异性来分离同工酶，在这种方法中，酶活性收集后与特异抗体结合，然后通过免疫层析、免疫电泳等技术来鉴定同工酶的存在和数量。
与电泳法相比，该方法具有更高的灵敏度和特异性，其测定结果更加准确和可靠。
但是，该方法需要引入复杂的生化试剂，并且其酶活性需在一定程度上受损，因此也存在一定的缺陷。
3、分子生物学方法分子生物学方法是近年来应用得更广泛的同工酶鉴定技术，它利用基因技术手段来分离和鉴定同工酶。
通过已知同工酶的基因序列来克隆或设计同工酶基因，然后将其表达在目标宿主细胞中，最终得到可表达的同工酶蛋白质，用于进一步的鉴别和功能研究。
这种方法的优点在于繁殖不依赖于生物体，可以通过基因转移在转化效率高的表达宿主中获得大量纯化的同工酶。
不过它也存在诸多限制，如同工酶分子可能存在多种异构体和修饰，需要进行多重克隆和特殊表达。
二、同工酶的生物学功能研究同工酶的生物学功能研究是对同工酶的生物学特性、生化性质、结构特征等方面的综合分析，从而为其理解和应用提供科学依据。
同工酶分析技术
第8章 同工酶分析技术由于酶是基因编码的产物，它在电场中迁移率的改变反映了酶蛋白的大小构形和肽链氨基酸的序列变化，即编码DNA顺序上的变化，所以可通过分析酶谱的变化来获得我们所需要的遗传信息。
在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。
等位酶（Allozyme）是“等位基因酶” 的简称，是从同工酶中派生出来的，它与同工酶既有区别又有联系。
同工酶是催化同一生化反应的、但在电场中的运动性质有所不同的同种酶的不同表现形式。
这是由于构成蛋白质亚基的氨基酸组成和顺序有所不同而造成的。
这一概念是广义的，它包括不同基因座位和同一基因座位的不同等位基因所编码的同一种酶，以及转录后酶变体的所有电泳后的表现型。
近期文献所提到的同工酶则是狭义的，仅指由不同基因座位所编码的同一种酶的不同形式。
由于多数酶的不同形式是共显性的，一个基因座位上两个或多个等位基因是能表达的，它们所编码的多肽链在凝胶上作为酶基因的表现型都能显示出谱带而被看见，因此可将它们作为遗传学研究对象。
以下将介绍同工酶分析的一些技术和方法。
8.1 淀粉胶电泳的技术和方法电泳有很多种支持介质，其中淀粉是最容易使用的一种。
由于淀粉凝胶孔径的大小和蛋白质分子相近，因此它提供了一个很好的分子筛。
同时每一块胶都可以切成几片进行不同酶系统的染色，因而节约时间、人力、物力和财力。
淀粉胶电泳不需要任何复杂的装备，所有必须的装备都能在实验室找到。
而且，与聚丙烯酰胺比较，淀粉是无毒的，最重要的一点是，淀粉胶上显色的结果和聚丙烯酰胺胶显色的结果一样好，多数时候甚至更好。
8.1.1 淀粉胶的制备8.1.1.1 水解淀粉进口水解淀粉价格昂贵。
我们实验室用自己水解的淀粉（除淀粉酶用进口淀粉或者聚丙烯酰胺胶外），进行蛋白质和酶的电泳，其效果一般都比较理想。
水解方法如下： 器具：三角烧瓶（5 000ml），真空泵，布氏漏斗（5 000ml，直径25～30cm）和布氏漏斗同直径的圆形滤纸，37℃烘箱，移液管。
同工酶鉴定细胞原理
同工酶鉴定细胞原理
同工酶鉴定是一种常用的细胞分析技术，其原理基于同一个细胞中不同同工酶的存在与活性差异。
同工酶是指在化学结构上相似但功能略有差异的酶。
同一种酶在不同个体或细胞中可能由于基因突变而出现略有不同的同工酶。
通过酶活性的检测，可以发现这种同工酶的存在与活性差异，并通过对同工酶的检测来鉴定细胞。
同工酶鉴定的步骤如下：
1. 细胞提取：将待鉴定的细胞或组织进行蛋白质提取，通常使用的方法是细胞裂解液或其它组织裂解方法。
2. 酶活性检测：采用适当的实验方法，测定同一种酶在不同个体或细胞中的活性差异。
常用的检测方法包括酶活性测定技术、免疫印迹（Western blotting）、酶电泳等。
3. 分离与鉴定：通过酶电泳或其它分离技术，将不同同工酶分离开来，然后通过染色、抗体检测或质谱分析等方法来确定同工酶的存在与差异。
4. 结果分析：通过对同工酶分离和鉴定的结果进行比对和分析，可以鉴定细胞之间的差异，例如细胞类型、发育阶段、疾病状态等。
同工酶鉴定技术可以应用于许多领域，如生物学、医学、食品
科学等，可以用于研究细胞的功能、基因表达调控、代谢变化、疾病诊断等方面。
同工酶分析自材料
一、植物过氧化物酶同工酶的测定：
【实验原理】
以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
PAGE 兼有电荷效应和分子筛效应。
被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。
利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2联苯胺的溶液染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多余有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。
二、
三/
，过氧化氢酶（CAT）是由一条肽链组成的同四聚体酶。
同工酶的分析是根据同工酶分子结构的
差异，通常用电泳技术加以分离后，再根据
它们的催化作用相同因而可能使用同一显色
法测定其酶活性的原理获得同工酶谱。
一个基因的产物也可能形成一个
以上的同工酶带。
这可能是由于多肤合成之
后的分解(形成大小不同的酶分子)或极性修
饰或分子构型发生改变而产生多条酶带。
实验十-同工酶分析
实验四同工酶分析同工酶概述酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。
在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。
它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。
把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。
同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。
大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。
在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。
现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。
可以进行同工酶分析的酶已有100多种。
不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。
从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：（一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。
该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。
这个学说有广泛的实验证据。
如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基，按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。
（二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。
因而产生同工酶。
由不同基因引起的同工酶存在于同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。
（三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。
经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。
同工酶鉴定技术
同工酶鉴定技术同工酶鉴定技术是一种常用的生物学实验技术，用于鉴定和比较不同生物体中的同工酶。
同工酶是指在同一种酶的功能相同但结构稍有差异的变种，其产生是由于基因突变或多态性所致。
同工酶鉴定技术可以帮助研究人员进行种属鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评估等。
同工酶鉴定技术基于酶的特异性反应，通过测定酶的催化活性来确定同工酶的存在和差异。
该技术通常包括以下步骤：1. 提取酶：首先，从待测样品中提取酶。
提取方法根据不同的酶类型和待测样品的特性而有所差异。
一般来说，可以通过细胞破碎、超声波处理或离心等方法将酶从细胞或组织中释放出来。
2. 准备底物：接下来，准备适当的底物，以便酶能够催化反应。
底物的选择取决于待测酶的特性和所需的反应结果。
3. 反应条件优化：为了获得准确可靠的结果，需要优化反应条件。
这包括反应温度、pH值、反应时间和底物浓度等。
4. 酶活性分析：将提取的酶与底物进行反应，观察并测量反应产物的生成情况。
不同的同工酶可能会产生不同的反应产物，通过对产物进行分析和比较，可以确定同工酶的存在和差异。
5. 数据分析和解释：根据实验结果，进行数据分析和解释。
可以使用统计学方法对同工酶数据进行聚类分析、相似性分析和群体结构分析等。
同工酶鉴定技术有许多优点。
首先，它是一种相对简单和经济的技术，不需要复杂的设备和昂贵的试剂。
其次，同工酶鉴定技术可以同时分析多个样品，提高工作效率。
此外，该技术还可以对不同种群、不同物种和不同组织进行比较和分析，为遗传学研究提供了有力的工具。
然而，同工酶鉴定技术也存在一些局限性。
首先，同工酶的鉴定结果受到环境因素的影响，如温度、pH值和离子浓度等。
其次，同工酶鉴定技术对样品数量和质量要求较高，样品来源的限制也会影响到结果的准确性。
此外，同工酶鉴定技术只能鉴定已知的酶，无法发现新的酶。
在实际应用中，同工酶鉴定技术被广泛应用于种属鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性评估等领域。
例如，在生物多样性保护和物种保护中，同工酶鉴定技术可以用于鉴定和保护濒危物种。
同工酶的检测方法和原理
同工酶的检测方法和原理同工酶是指在氨基酸序列相同但功能不同的蛋白质之间的酶。
在不同的物种中，由于进化的压力和不同的生理需要，可能会形成具有相同功能但结构和氨基酸序列不同的酶，这些酶被称为同工酶。
同工酶的存在使得生物体能适应不同的环境和生理需求。
检测同工酶的方法可以分为直接方法和间接方法，下面将分别介绍。
直接方法主要是通过电泳技术进行测定，包括凝胶电泳和等电聚焦电泳。
1. 凝胶电泳：是一种常用的同工酶检测方法。
凝胶电泳是将样品分离成带状，在电场作用下，带状样品经由电泳从一端移动到另一端。
电泳分离的原则是根据同工酶的电荷和分子大小的差异。
凝胶电泳通常使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶，将样品施加在凝胶表面形成样品带状条带。
样品通过电泳迁移时，在凝胶中形成不同迁移距离的带状物，通过对不同带状物进行染色，可以检测到同工酶。
2. 等电聚焦电泳：等电聚焦电泳是根据同工酶的等电点差异进行分离。
等电聚焦电泳是一种高分辨率电泳技术，利用一个有缓冲液梯度的平板进行分离。
在平板两端施加电场，使样品中的蛋白质在不同的等电点处停留。
等电聚焦完成后，通过其他电泳技术如SDS PAGE等对蛋白质进行分离和检测。
间接方法主要是通过特定底物的测定来检测同工酶的活性。
1. 酶活性测定：通过酶的催化反应来测定同工酶的活性。
这种方法通常使用特定底物，底物与酶发生催化反应后，产生某种可检测的物质，例如：酶联免疫吸附测定法（ELISA）通过酶催化反应来检测同工酶的存在和活性。
2. 免疫学检测：使用特异的抗同工酶抗体进行检测。
抗体与酶形成复合物，然后通过标记系统如酶标记二抗、荧光标记等来检测复合物的存在和活性。
典型的方法如免疫印迹（Western Blotting）可以通过抗体和抗原相互作用来检测同工酶的存在。
同工酶检测的原理是通过不同的分离和检测技术来找到同工酶的差异。
这些差异可以是电荷、分子大小以及底物的反应等。
通过对同工酶的差异进行测定和分析，我们可以了解同工酶的分布、活性和功能等。
10种蓖麻过氧化物酶同工酶分析
种策 略之 一 ．
同工 酶或 叫做 酶 的多种 分 子形 式 ， 有相 同的底 物 ， 电泳 迁 移 率不 同． 同工酶 是 基 因表 达 的产 具 但 由于
物 ， 以通 过酶谱 的分析 也 能反 映基 因 的存在 及 表达 规律 ． 文从 同工 酶水 平上 区分蓖麻 高 秆 品种 和 矮秆 所 本 品系 ， 以为 培育矮化 品种奠 定基础 ．
１ 材 料 和 方 法
１１ 材 料 ．
材 料 取 自内蒙 古通 辽 市农 业科 学 院 ， 中 １ 为高 秆 蓖麻 品种通 蓖 ５ ，一 ０ 为矮 化 蓖麻 品系 ． 其 号 号 ９ ｌ号
ＬＩ Ｕ Ｐｅ ．Ｚ ｎｇｔ ＨＡＮＧ Ｃｈ ｎ ｌ ｎ ， ＵＡＮ Ｓ ｉ ｈ ｉ Ｃ ２ ｕ —ａ Ｌ ｈ — ｕ ＨＥ Ｙｏ ｇ ｓ ｅ ｇ＇ ， Ｎ ｎ — ｈ ｎ
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（ ． ｎ ｒ Ｍｏ ｇ ｌ ｉｅ ｓ ｙ ｆｒ Ｎａｉｎ ｌ ｉｓ ｏ ｇｉｏ ０ ８ ４ Ｃ ｉａ １Ｉ ｅ ｎ ｏｉ Ｕｎｖｒｉ ｏ ｔ ａｉｅ ，Ｔ ｎ ｌ ２ ０ ２， ｈｎ ； ｎ ａ ｔ ｏ ｔ ａ ２Ｉ ｎ ｒ Ｍｏ ｇ ｌ ｎ ｕ ｔ ａ ｇｎ ｅｉｇ Ｒｅｅ ｒｈ Ｃｅ ｔｒｏ ｎｖ ｒｉｅ ｒＣａｔｒ ｏ ｇｉｏ ０ ８ ４ ， ｉａ ． ｅ ｎ ｏｉ Ｉｄ ｓｒ ｌＥｎ ｉｅ ｒｎ ｓａｃ ｎｅ ｆ Ｕ ｉｅｓｔ ｓ ｆ ｓｏ， ｎ ｌ ２ ０ ２Ｃｈｎ ） ｎ ａ ｉ ｉ ｏ Ｔ ａ
Ａｂｓ ｒ ｃ ： Ｔｈｅ ｐ ｒ ｘｉａ ｅ ｓ ｅ ｚ ｍ ｅ ｏ １ ｖ ｒｅ ｉｓ ｏ ｃ ｔｒ ｂ ａ ｗｅ ｅ ｔ ｉｄ ｂｙ ｐ ｌ ｃｙ ａ ｄ ｇｅ ｔａ ｔ ｅ ｏ ｄ ｓ ｉｏ ｎ ｙ ｓ ｆ ０ ａ ｉｔｅ ｆ ａｓｏ ｅ ｎ ｒ ｓｕｄ ｅ ｏｙａ ｒ ｌ ｍｉ ｅ ｌ
同工酶分析方法
取油菜样品0.5-1.Og于液氮中研磨，用5Ommol/L的磷酸缓冲液(pH7.0 )提取，12000 X g, 4℃离心15min，收集上清液，加入占样品总体积25%的甘油和占样品总体积约1.5溟酚兰放入一84℃的超低温冰箱中保存用作同工酶分析。
同工酶测定采用聚丙烯酞胺垂直板状电泳。
分离胶浓度6.0 } ( ddH20 4.313m1Tris-HC以pH8.9) 0.938m1 } 30%胶1.5m1 } 0.13mmol/L核黄素0.75m1和TEMED 4},1) 7.5 } (ddH20 3.938m1 } Tris-HC吻H8.9) 0.938m1 } 30%胶1.875m1 } 0.13mmol/L核黄素0.75m1和TEMED 4p,1)或10%(ddH20 3.304m1，Tris-HCL(pH8.9) 0.938m1，30%胶2.5m1 } 0.13mmo1/L核黄素0.75m1和TEMED 4闰)，依据同工酶的类型和所测蛋白的大小而定，pH8.9;浓缩胶浓度为4.0% ( ddH20 0.818m1 } Tris-HCL(pH6.7) 0.375m1 30%胶0.4m1 } 0.13mmol/L核黄素0.409m1 } TEMED 15 p1和50%蔗糖1.2m1) } pH6.7 ; 30%胶的配制:29g丙烯酞胺，1g N,N一亚甲基双丙烯酞胺，重蒸水加至100m1。
电极液为Tris一甘氨酸，pH8.3。
以澳酚兰为前沿指示剂，电流强度为20mA/板，电泳2 小时左右，整个过程在4℃冰箱中进行。
过氧化物酶(POD)同工酶用联苯胺一抗坏血酸染色法染色。
酉旨酶(EST)同工酶用醋酸蔡酷坚牢蓝染色法染色;过氧化氢酶< CAT)同工酶用硫代硫酸钠一碘化钾染色法(分离胶中加淀粉)染色;超氧化物歧化酶(SOD)同工酶用氮蓝四哇染色法染色。
多酚氧化酶(PPO)同工酶用对苯二胺一邻苯二酚染色法染色。
同工酶试验方法
同工酶试验方法同工酶啊，这可是个很有意思的东西呢！就好像我们人有不同的性格特点一样，同工酶也有着自己独特的性质和表现。
那要怎么去研究它们呢？首先啊，我们可以用凝胶电泳法。
这就好比是一场赛跑，让同工酶们在凝胶这个“跑道”上奔跑起来。
不同的同工酶会因为它们自身的特点，在跑道上跑出不同的轨迹，我们就能清楚地看到它们的区别啦！是不是很形象呢？还有一种方法是组织化学染色法。
这就像是给同工酶们穿上了特别的“衣服”，让它们变得更加显眼，我们可以很容易地就发现它们呢。
想象一下，同工酶们穿上了五颜六色的衣服，那场景该多有趣呀！另外呢，等电聚焦电泳法也是个不错的选择。
它就像是一个精准的定位仪，能够把同工酶们准确地分离开来，让我们能更细致地观察它们。
酶活性测定法也很重要哦！就好像我们要看看同工酶们都有多大的“本领”，通过测定它们的活性，来了解它们的功能。
免疫分析法呢，则像是一个专门识别同工酶的“小侦探”，能够准确地找到我们想要研究的那些同工酶。
这些试验方法都各有各的特点和用处，就像我们生活中的各种工具一样，每一个都不可或缺呀！我们在进行同工酶试验的时候，要根据具体的情况选择合适的方法，这样才能得到最准确、最有用的结果。
比如说，如果我们想要快速地了解同工酶的大致情况，那凝胶电泳法可能就比较合适；要是想更深入地研究同工酶的功能，那酶活性测定法就派上用场啦。
在进行这些试验的时候，可得细心再细心，就像对待珍贵的宝贝一样。
稍有疏忽，可能就会让结果出现偏差哦！那可就得不偿失啦。
总之啊，同工酶试验方法是我们探索同工酶世界的重要途径，通过这些方法，我们能更好地了解同工酶的奥秘，为生物学、医学等领域的研究提供有力的支持。
所以呀，我们一定要好好掌握这些方法，让它们为我们的科学研究发挥出最大的作用！你们说是不是呢？。
同工酶分析
锰胁迫下美洲商陆CAT, POD活性的变化以及同工酶谱分析专业：生物科学作者：范英姿指导老师：彭喜旭，王海华(湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201)摘要:采用室内培养及生理指标测定方法，研究了不同锰胁迫水平（0.005，0.010，0.015 mol/L）下，美洲商陆幼苗中过氧化氢酶（CAT）活性、CAT和过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化，结果表明：随着锰浓度的增加，美洲商陆幼苗中CAT活性呈一个先增大后降低的趋势，CAT同工酶电泳分析表明，处理和对照中，CAT谱带均为一条，迁移率相同(Rf=0.41)；CA T谱带亮度变化表明，第2d的10000 mmol/L CAT同工酶活性最强，而到第4d美洲商陆CA T活性降低，与CA T紫外光光度计测活性结果一致；POD同工酶电泳分析表明，POD活性变化趋势与和CA T一致，提示在0.005～0.015 mol/L浓度范围的锰胁迫下，美洲商陆的活性氧清除能力增强，而0.015 mol/L时，美洲商陆活性氧清除能力下降。
关键词:锰胁迫；美洲商陆；CA T；POD；同工酶谱分析Manganese to deal with excessive land CAT, POD and changes in the activity of theisozyme spectrum analysisMajor：Life SciencesAuthor: Fan Yingzi Director: Peng Xixu, Wang Haihua(School of Life Science, Hunan University of Science and Technology Xiangtan 411201, Hunan)Abstract: Indoor cultivation and use of physiological indicators of method to study the different stress levels of manganese (0.005,0.010,0.015 mol / L), Phytolacca americana seedlings in the catalase (CAT) activity, CAT and peroxidase (POD) Isozyme bands change, The results showed that: With the increasing concentration of manganese, Phytolacca americana seedlings in the CAT activity increased after the first was a decreasing trend, CAT isoenzyme electrophoresis analysis showed that the treatment and control of, CAT are a band, the same rate of migration (Rf = 0.41); CAT bands brightness changes show that the first 2 d of 10000 mmol / L CAT isozyme of the strongest, and to the first American to land 4 d CAT activity decreased, and CAT ultraviolet spectrometer measurement of results are consistent; POD isoenzyme electrophoresis analysis showed that, POD activity of CAT and consistent with the trend, Tip in the 0.005 ~ 0.015 mol / L manganese concentration of the stress, the Inter-American to land the ability to enhance the removal of reactive oxygen species, and 0.015 mol / L, Phytolacca americana active oxygen scavenging ability.Key words: manganese stress; Phytolacca americana; CAT; POD; isozyme spectrum analysis.前言随着环保意识的增强，人们逐渐认识到土壤重金属污染将对环境和人类健康产生重大影响。
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实验四同工酶分析同工酶概述酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。
在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。
它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。
把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。
同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。
大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。
在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。
现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。
可以进行同工酶分析的酶已有100多种。
不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。
从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：（一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。
该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。
这个学说有广泛的实验证据。
如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基，按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。
（二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。
因而产生同工酶。
由不同基因引起的同工酶存在于同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。
（三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。
经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。
（四）多肽链的续发变化多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。
续发变化如果只改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产生不同的同工酶。
常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。
（五）酶空间构象的差异组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。
从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。
因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。
同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而拓宽了该技术的使用范围。
通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。
显色的主要方法有以下几种：（一）呈色法直接利用酶作用于底物产生有色产物。
如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。
同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。
（二）化学反应显色法采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显色，借以指示出酶所在的位置和活力大小。
如酯酶作用于萘酯，再用坚牢蓝和该酶反应产物作用显示出褐色，标出酶的位置。
又如用化学染色剂NBT（硝基四唑氮蓝）照光后可还原成兰色的甲，而超氧化物歧化酶（SOD）分布区域抑制了NBT光还原作用，故在兰色的背景上呈现出清晰的SOD谱带。
前者称为阳性染色法，后者为阴性染色法。
（三）电子转移染色法应用酶将电子转移给染料，通过染料变色显示出酶的区带。
此法仅使用于脱氢酶、氧化酶同工酶的染色，如下图所示：（四）荧光染色法借助酶促反应使无荧光底物变成高荧光的产物或使有荧光的底物转变成荧光熄灭的产物，用荧光仪进行检测。
其中又有阳性和阴性染料之分：阳性荧光染料应用较广泛的是4-甲基伞形酮的衍生物。
在水解酶催化过程中，在酸性或中性条件下得到的水解产物4-甲基伞形酮，用氨气熏蒸或用碱性缓冲液将反应系统调成碱性，则出现强烈荧光。
该法灵敏度高，但易弥散，必须及时检测并记录酶谱。
阴性荧光染料是利用还原型NADH和NADPH在紫外线照射下能产生黄色荧光，而氧化态的NAD+和NADP+不产生荧光的原理，在氧化还原酶作用的底物内加入定量的还原态NADH和NADPH，在紫外灯照射下，有没存在区域NADH或NADPH变成氧化态（NAD+或NADP+），显示出暗带或弱荧光谱带。
（五）偶联酶显色法有些酶促反应的底物或产物均不能显色，在反应体系中加入特异性的酶，即可使产物显色。
如要分离鉴定己糖激酶同工酶，可偶联6-磷酸-葡萄糖脱氢酶催化反应，只要检测脱氢酶的电子转移反应，即可测出己糖激酶的存在。
上述显色后的同工酶谱放置时间过长易退色，必须用照相或光电扫描仪等手段适时记录。
免疫化学法是分离同工酶的另外一种方法，多基因位点与复等位基因决定的同工酶间，其氨基酸组成有较大的差异，故有不同的抗原性。
利用分离、纯化的同工酶，通过免疫学方法制备出相应的抗血清，再加到同工酶混合样品之中，该抗体即可与相应的同工酶抗原形成免疫复合体沉淀，而将免疫性不同的同工酶留在样品液中，从而达到分离的目的。
有时可以从沉淀中回收全部酶活力。
如肌酸激酶同工酶，只要测出上清夜中残余酶活力，再从不加抗体样品中测出总活力，两者之差即为被沉淀同工酶的活力。
采用免疫学方法鉴定同工酶，由于抗原抗体反应特异性强，灵敏度高，可对同工酶进行定性、定量分析，但此法仅适用于抗原性差异比较大的同工酶的鉴定。
层析法可用于同工酶之间分子量比较接近，表面电荷差异较大的同工酶的分离。
最后用一般酶活测定方法分别测定洗脱液中同工酶的活力。
利用亲和层析鉴定同工酶，依据同工酶和相应的配基（如底物、辅酶、抑制剂、抗体等）亲和力不同的原理，将同工酶混合样品液缓缓流过固相配基层析柱，进行亲和吸附，然后再选用不同的缓冲液将吸附程度不同的同工酶顺次洗脱下来，从而达到分离的目的。
层析法样品承载量大，操作条件温和、简单，更适于纯化或制备不同型的同工酶，是研究同工酶结构、功能的重要手段。
同工酶技术广泛应用于医学、生理学、分类学、病理学、遗传学及育种学中。
同工酶技术在遗传育种中的应用主要体现在种质资源的研究、杂交优势的预测、体细胞融合杂种的鉴定等方面。
（1）按照一个基因编码一个同工酶亚基的理论，可以从同工酶的表现型变异而直接推测其基因的变异水平。
测定酶活力即可反应出DNA结构差异，甚至是DNA上一个碱基的微小差异。
因此，同工酶分析技术是研究物种起源、演化及变异程度的最有价值的手段之一。
种质资源在品种改良中的应用，关键在于对收集材料的鉴定研究的程度。
对栽培植物和近源野生植物材料同工酶谱进行分离和鉴定，依据同工酶谱相同值大小，直观而科学地确定物种亲缘关系远近，演化过程中的变异程度。
（2）在杂种优势的预测中，具有优势的杂种，常出现新的为双亲所不具备的同工酶谱。
通过PAGE并染色后会发现，有优势的杂种一代除出现双亲的酯酶谱型之外，还出现了新的“杂种酶带”。
这种新酶谱在代谢中，具有比亲代更高的活性。
同工酶分析技术还可用于遗传基因定位、远缘杂种鉴定、雄性不育等领域。
植物生长发育的不同阶段，不同组织、不同器官不仅酶分子表现出阶段特异性和组织特异性，同工酶也有同样的趋势。
种子活力、组织与器官分化、生长及胚胎发育、环境因素和植物激素等均可额影响同工酶的变化，使得同工酶技术在生理学中也得到了广泛的应用。
同工酶技术还广泛应用于病理诊断和临床治疗中。
同工酶是生物体中的天然标记物，根据同工酶的变化，可以反映生物体的感病情况。
如在正常人的血清中，乳酸脱氢酶的存在是LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH4＞LDH5。
若LDH1失常即LDH1＞LDH2，为急性心肌梗塞、心肌损伤、心肌病及溶血性贫血的征兆；若LDH5＞LDH4，多见于肝脏损伤、皮肌炎、肌肉损伤等疾病。
同工酶技术还可作为植物抗病性鉴定和筛选的生化指标。
当病原微生物侵染生物体后，可引起组织内的代谢变化，进而可诱导产生许多新的同工酶，而且新产生的同工酶带活性高，病情越重同工酶数目越多，染色也就越浓。
因此同工酶的活性和数量变化可作为生物抗病性鉴定的生化指标。
实验方法同工酶的提取与一般蛋白质提取原则相同，电泳方法同聚丙烯酰胺凝胶电泳，不再陈述。
以下介绍几种同工酶染色方法。
1.酯酶同工酶染色液配制：称取坚牢蓝RR盐30毫克，溶于30毫升pH值6.4磷酸缓冲溶液中，过滤后，加2毫升1%α-醋酸萘酯（少许丙酮溶解后，用80%酒精配），1毫升2%β-醋酸萘酯（同上）于滤液中。
染色方法：电泳完毕将脱去的凝胶立即转移至染色液中，37℃10—15分钟，即可呈现出棕红色的酯酶同工酶谱带，然后用水漂洗几次，置于7%醋酸中保存。
酯酶的不同同工酶对醋酸-α萘酯和醋酸-β萘酯有不同的亲和力，而且这种亲和力是稳定的，即每次先与醋酸-α萘酯或醋酸-β萘酯作用的同工酶，每次都显褐色或红色，如果是醋酸-α萘酯和醋酸-β萘酯同时能作某些同工酶的底物，则该同工酶带总是染成紫褐色。
2.过氧化物同工酶染色液的配制：以下三种染色液中任选一种。
①0.1%联苯胺（在0.1mol/L,pH5.6醋酸缓冲液100ml中含0.1g联苯胺）100ml,临用前加1.0ml3%过氧化氢。
②2%联苯胺（2g联苯胺溶于18ml冰醋酸，加蒸馏水至100ml）20ml，抗坏血酸70.4mg，20ml 0.6%过氧化氢和60ml水，临用前混合。
③联大茴香胺250mg溶于140ml95%乙醇中，加水20ml，临用前加过氧化氢4~5ml（13%）。
固定保存液：甲醇：冰醋酸：水=5：1：5染色：将配好的染色液倒入白瓷盘内（或试管内）的凝胶板（或柱）上，室温放置1~5分钟即显现出兰色区带。
以无离子水漂洗数次，放在固定保存液中，区带渐渐变成棕色。
3.乳酸脱氢酶同工酶染色液的配制临用前按20∶1的比例混合下列甲、乙二试剂：试剂甲：于一棕色瓶中加入碘化硝基四唑蓝（INT）20mg，加蒸馏水8ml，避光置50 ℃水浴中作用30min，不时振摇助溶，溶解后加入CoI20mg，乳酸锂0.2g，乙氨基乙甲基1、3丙二醇缓冲液2ml，全部溶解后冰箱储存，至少可用两周。
试剂乙：取吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）配制1mg/ml溶液，置棕色瓶中保存。
此溶液不宜久置，显微红色即弃取。
甲、乙二液混合配制好后应立即使用，整个显色过程都应该避光。